Octet® 非標記分子互作儀在甲流基礎研究及藥物研發中的應用
正值流感高發季節，近期全國各地均出現了不同程度的群體性感染。 流感主要流行期為12月至次年3月，相較于普通感冒，流感的傳染性更強，傳播速度快，且癥狀更重，多伴有高熱（≥38℃）、咽痛、咳嗽和肌肉酸痛等全身癥狀。季節性流行的流感多為甲型流感病毒中的H1N1和H3N2亞型，病毒顆粒呈球狀，直徑為80-120nm，囊膜上有許多突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經氨酸酶NA和M1/M2蛋白。
圖1. 流感病毒結構圖：外圍標注的是結構蛋白，內部標注的是攜帶的非結構蛋白和結構蛋白的基因。
在甲流的基礎研究以及藥物研發方面，賽多利斯基于生物層干涉技術的Octet® 非標記分子互作儀擁有非常多CNS積累的案例，能夠為科學研究提供新的洞察！
Octet® 在甲流侵染機制中的應用
流感病毒識別的是一類在動物細胞表面廣泛存在的多糖，禽類受體是α2’3-唾液酸，而人類受體是α2’6-唾液酸，禽流感病毒能夠感染人類，就是因為流感病毒表面蛋白發生了突變，其結合的受體從禽類受體向人受體轉變導致。2013年，H7N9在中國華東地區爆發，掀起了流感病毒的研究的新一輪熱潮。當年的一篇NATURE文章就用實例證明了Octet® 是檢測流感病毒受體親和力的神器[1]。
之所以稱為“神器”，因為這篇NATURE文獻作者發現細胞表面的受體密度與固化在Octet® 的鏈霉親和素傳感器上的受體密度非常相似，所以是非常好的研究流感病毒與其受體親和力的工具，而且可以直接將病毒而不是表面蛋白作為分析物。只需要將受體多糖在鏈霉親和素傳感器上固化成不同密度，結合同一濃度（100pM）的流感病毒，以固化密度（信號大小）和結合信號作圖，就可以評估受體和病毒的結合活性。
圖2. 曲線上升的越快，則說明親和力越高。比如X-31型流感病毒,其對人受體的親和力比禽類受體的要強。
由于多重結合等復雜因素，流感病毒顆粒結合受體后不能有效洗脫，固化受體的探測器表面的重生很難獲得實現。生物層干涉（BLI）技術單個探針的成本相對較低，使得我們可以以較低成本廣泛測試獲得最優的檢測條件，優化后的條件具有較高的實驗重現度，可以實現橫向對比不同毒株的結合能力。幫助我們在流感病毒的受體結合、抗體結合方面做出一系列的工作。
作者簡介
熊曉犁博士
中科院廣州生物醫藥與健康研究院研究員
2011年博士畢業于布里斯托大學細胞與分子醫學系，博士畢業后師從皇家學會副會長流感病毒專家John Skehel爵士進行流感病毒的研究，運用X射線晶體學的方法率先解析了感染人類的禽流感毒株如H5N1，H7N9，H10N8的凝血素與受體形成的復合物的結構特征，并使用Biolayer Interferometry（生物層干涉）的方法測量了活病毒與人類和禽類受體分別的結合能力。作為第一作者，這一系列工作成果被Nature（3篇），PNAS（1篇），Virology （1篇），Virus Research（1篇）雜志分別發表。詳細信息
這種方法最真實的反應出人體環境中的病毒結合能力，所以自從這種方法建立成功后，便得到了廣泛的應用，多篇文獻（含多篇CNS）也使用了這個方法來研究甲流病毒的進化[2-8]。比如下面的一些發現：
圖3.Octet® 數據發現2001年以來H3N2型流感對人受體親和力在下降，可能與近10年來H3N2導致疾病的嚴重程度下降相關[2]。
圖4. Octet® 發現可以感染人類的H5型病毒完全去除了與禽受體的結合能力，保留了與人受體結合能力，H7型病毒對兩者的結合能力相當。而H3型保留了兩者的結合能力，對人受體結合更強[3]。
Octet® 在藥物研發領域中的應用（基于受體配體競爭實驗）
研究機理的目的是應用，只要在前述方法基礎上，在病毒中混入抑制劑，后與受體相互作用，便可通過競爭反應檢測抑制劑的藥效[9-11]。
圖5. Octet® 將多糖受體固化在傳感器上，與小分子抑制劑和流感病毒的混合物反應發現，抑制劑可以部分阻斷病毒和受體的結合[11]。
圖6. Octet® 發現抗體抑制劑FLD194可以阻斷病毒與人受體和禽受體的結合[12]。
固化了多糖受體的傳感器還可以再生重復使用，達到降低使用成本的目的[11]！
圖7. 只要在病毒緩沖液中加入奧司他韋（OC），阻止病毒NA蛋白對多糖的剪切作用，就可以用酸性溶液洗掉病毒進行再生。
當然，還有很多使用Octet® 進行基于小分子藥物[13,14]、抗體藥物[15-20]和流感靶點親和力測試的案例，這里就不一一列舉了。
10年來，已經有近40篇使用Octet® 直接檢測流感病毒與多糖受體親和力的文獻發表，并在此基礎上，進行了藥物的開發。真金不怕火煉，一次次的被選擇真正說明Octet® 是檢測流感病毒與其受體的神器！
最后提醒大家:
如果得了流感：需要多休息，多喝水，流感為自限性疾病，休息期間避免前往人員聚集的地方。如自覺癥狀有所加重，建議佩戴好口罩前往就近的發熱門診就診，根據醫囑服用抗流感病毒藥物。對于新冠的預防措施對于流感預防同樣有效：勤洗手、正確洗手，做好手衛生。保持環境清潔和通風。保持良好的呼吸道衛生習慣，咳嗽或打噴嚏時，用上臂內側或紙巾、毛巾等遮蔽住口鼻。重點人群建議每年接種流感疫苗。
下載文檔
下載《病毒學基礎研究及藥物研發應用文集》，了解病毒學及病毒與免疫系統互作研究的前沿理論與技術。
-參考文獻-
[1]Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus.nature,2013
[2]Evolution of the receptor binding properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1218841110
[3]Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans. doi:10.1038/nature12372
[4]Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 2013 December 6; 342(6163): 1230–1235
[5]Recent evolution of equine influenza and the origin of canine influenza. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1406606111
[6]Changes in the hemagglutinin of H5N1 viruses during human infection – Influence on receptor binding. Virology 447(2013)326–337
[7]Enhanced human receptor binding by H5 haemagglutinins. Virology456-457(2014)179–187
[8]Receptor binding by H10 influenza viruses. doi:10.1038/nature13443
[9]Biophysical Measurement of the Balance of Influenza A Hemagglutinin and Neuraminidase [10]Activities. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 10, pp. 6516–6521
[11]Preventing Influenza A Virus Infection by Mixed Inhibition of Neuraminidase and Hemagglutinin by Divalent Inhibitors. J. Med. Chem. 2022, 65, 7312−732
[12]Structures of complexes formed by H5 influenza hemagglutinin with a potent broadly neutralizing human monoclonal antibody。Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 July 28; 112(30): 9430–9435.
[13]Structure-based optimization and synthesis of antiviral drug Arbidol analogues with significantly improved affinity to influenza hemagglutinin. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2017
[14]A Potent Anti-influenza Compound Blocks Fusion through Stabilization of the Prefusion Conformation of the Hemagglutinin Protein. Infectious Diseases,2015
[15]A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.Science,2013
[16]Unique structural solution from a VH3-30 antibody targeting the hemagglutinin stem of influenza A viruses. NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:559
[17]Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase- Reactive Antibodies. Cell
[18]Viral Receptor-Binding Site Antibodies with Diverse Germline.Cell
[19]A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. SCIENCE,2015
[20]Optimization of affinity, specificity and function of designed influenza inhibitors using deep sequencing. nature biotechnology
圖1. 流感病毒結構圖：外圍標注的是結構蛋白，內部標注的是攜帶的非結構蛋白和結構蛋白的基因。
在甲流的基礎研究以及藥物研發方面，賽多利斯基于生物層干涉技術的Octet® 非標記分子互作儀擁有非常多CNS積累的案例，能夠為科學研究提供新的洞察！
Octet® 在甲流侵染機制中的應用
流感病毒識別的是一類在動物細胞表面廣泛存在的多糖，禽類受體是α2’3-唾液酸，而人類受體是α2’6-唾液酸，禽流感病毒能夠感染人類，就是因為流感病毒表面蛋白發生了突變，其結合的受體從禽類受體向人受體轉變導致。2013年，H7N9在中國華東地區爆發，掀起了流感病毒的研究的新一輪熱潮。當年的一篇NATURE文章就用實例證明了Octet® 是檢測流感病毒受體親和力的神器[1]。
之所以稱為“神器”，因為這篇NATURE文獻作者發現細胞表面的受體密度與固化在Octet® 的鏈霉親和素傳感器上的受體密度非常相似，所以是非常好的研究流感病毒與其受體親和力的工具，而且可以直接將病毒而不是表面蛋白作為分析物。只需要將受體多糖在鏈霉親和素傳感器上固化成不同密度，結合同一濃度（100pM）的流感病毒，以固化密度（信號大小）和結合信號作圖，就可以評估受體和病毒的結合活性。
圖2. 曲線上升的越快，則說明親和力越高。比如X-31型流感病毒,其對人受體的親和力比禽類受體的要強。
作者說
由于多重結合等復雜因素，流感病毒顆粒結合受體后不能有效洗脫，固化受體的探測器表面的重生很難獲得實現。生物層干涉（BLI）技術單個探針的成本相對較低，使得我們可以以較低成本廣泛測試獲得最優的檢測條件，優化后的條件具有較高的實驗重現度，可以實現橫向對比不同毒株的結合能力。幫助我們在流感病毒的受體結合、抗體結合方面做出一系列的工作。
作者簡介
熊曉犁博士
中科院廣州生物醫藥與健康研究院研究員
2011年博士畢業于布里斯托大學細胞與分子醫學系，博士畢業后師從皇家學會副會長流感病毒專家John Skehel爵士進行流感病毒的研究，運用X射線晶體學的方法率先解析了感染人類的禽流感毒株如H5N1，H7N9，H10N8的凝血素與受體形成的復合物的結構特征，并使用Biolayer Interferometry（生物層干涉）的方法測量了活病毒與人類和禽類受體分別的結合能力。作為第一作者，這一系列工作成果被Nature（3篇），PNAS（1篇），Virology （1篇），Virus Research（1篇）雜志分別發表。詳細信息
這種方法最真實的反應出人體環境中的病毒結合能力，所以自從這種方法建立成功后，便得到了廣泛的應用，多篇文獻（含多篇CNS）也使用了這個方法來研究甲流病毒的進化[2-8]。比如下面的一些發現：
圖3.Octet® 數據發現2001年以來H3N2型流感對人受體親和力在下降，可能與近10年來H3N2導致疾病的嚴重程度下降相關[2]。
圖4. Octet® 發現可以感染人類的H5型病毒完全去除了與禽受體的結合能力，保留了與人受體結合能力，H7型病毒對兩者的結合能力相當。而H3型保留了兩者的結合能力，對人受體結合更強[3]。
Octet® 在藥物研發領域中的應用（基于受體配體競爭實驗）
研究機理的目的是應用，只要在前述方法基礎上，在病毒中混入抑制劑，后與受體相互作用，便可通過競爭反應檢測抑制劑的藥效[9-11]。
圖5. Octet® 將多糖受體固化在傳感器上，與小分子抑制劑和流感病毒的混合物反應發現，抑制劑可以部分阻斷病毒和受體的結合[11]。
圖6. Octet® 發現抗體抑制劑FLD194可以阻斷病毒與人受體和禽受體的結合[12]。
固化了多糖受體的傳感器還可以再生重復使用，達到降低使用成本的目的[11]！
圖7. 只要在病毒緩沖液中加入奧司他韋（OC），阻止病毒NA蛋白對多糖的剪切作用，就可以用酸性溶液洗掉病毒進行再生。
當然，還有很多使用Octet® 進行基于小分子藥物[13,14]、抗體藥物[15-20]和流感靶點親和力測試的案例，這里就不一一列舉了。
10年來，已經有近40篇使用Octet® 直接檢測流感病毒與多糖受體親和力的文獻發表，并在此基礎上，進行了藥物的開發。真金不怕火煉，一次次的被選擇真正說明Octet® 是檢測流感病毒與其受體的神器！
最后提醒大家:
如果得了流感：需要多休息，多喝水，流感為自限性疾病，休息期間避免前往人員聚集的地方。如自覺癥狀有所加重，建議佩戴好口罩前往就近的發熱門診就診，根據醫囑服用抗流感病毒藥物。對于新冠的預防措施對于流感預防同樣有效：勤洗手、正確洗手，做好手衛生。保持環境清潔和通風。保持良好的呼吸道衛生習慣，咳嗽或打噴嚏時，用上臂內側或紙巾、毛巾等遮蔽住口鼻。重點人群建議每年接種流感疫苗。
下載文檔
下載《病毒學基礎研究及藥物研發應用文集》，了解病毒學及病毒與免疫系統互作研究的前沿理論與技術。
-參考文獻-
[1]Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus.nature,2013
[2]Evolution of the receptor binding properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1218841110
[3]Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans. doi:10.1038/nature12372
[4]Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 2013 December 6; 342(6163): 1230–1235
[5]Recent evolution of equine influenza and the origin of canine influenza. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1406606111
[6]Changes in the hemagglutinin of H5N1 viruses during human infection – Influence on receptor binding. Virology 447(2013)326–337
[7]Enhanced human receptor binding by H5 haemagglutinins. Virology456-457(2014)179–187
[8]Receptor binding by H10 influenza viruses. doi:10.1038/nature13443
[9]Biophysical Measurement of the Balance of Influenza A Hemagglutinin and Neuraminidase [10]Activities. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 10, pp. 6516–6521
[11]Preventing Influenza A Virus Infection by Mixed Inhibition of Neuraminidase and Hemagglutinin by Divalent Inhibitors. J. Med. Chem. 2022, 65, 7312−732
[12]Structures of complexes formed by H5 influenza hemagglutinin with a potent broadly neutralizing human monoclonal antibody。Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 July 28; 112(30): 9430–9435.
[13]Structure-based optimization and synthesis of antiviral drug Arbidol analogues with significantly improved affinity to influenza hemagglutinin. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2017
[14]A Potent Anti-influenza Compound Blocks Fusion through Stabilization of the Prefusion Conformation of the Hemagglutinin Protein. Infectious Diseases,2015
[15]A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.Science,2013
[16]Unique structural solution from a VH3-30 antibody targeting the hemagglutinin stem of influenza A viruses. NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:559
[17]Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase- Reactive Antibodies. Cell
[18]Viral Receptor-Binding Site Antibodies with Diverse Germline.Cell
[19]A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. SCIENCE,2015
[20]Optimization of affinity, specificity and function of designed influenza inhibitors using deep sequencing. nature biotechnology
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