誘導多能干細胞（iPSC，簡稱為iPS細胞），是一種由哺乳動物成體細胞經轉入轉錄因子等手段脫分化形成的多能干細胞，最早由日本學者山中伸彌的研究團隊于2006年發現。作為研究發育或疾病分子機制的理想研究工具，識別新治療靶點和高通量藥物篩選方面的廣闊應用[1]。

雖然iPSC研究已經取得長足進步，但在后續的研究過程中，仍存在一些挑戰。誘導iPSC生成的過程中，效率低、致瘤性、外源基因插入等問題仍然存在，iPSC誘導向人體組織細胞的過程中也存在成熟度不足、致瘤性風險等問題，需要培養方法的優化以及對重編程分子機制的進一步研究。要解決這一系列問題，必須通過高通量的研究發現新的靶點和培養及誘導方法，Incucyte® 實時活細胞分析系統和iQue® 高通量流式細胞儀可以滿足高通量研究的需求，為iPSC研究插上騰飛的翅膀。
 

Incucyte® 
 

iQue®
 
 
Incucyte® 在iPSC研究中的應用

工欲善其事，必先利其器。在iPSC的研究過程中，在不挪動細胞的前提下，Incucyte® 可以實現長時間實時監測iPSC向特定細胞類型分化的整個分化過程中細胞特征的變化，包括細胞形態、增殖、凋亡等指標，并且一次可放6塊培養板，滿足高通量活細胞成像的要求。

iPSC研究大致有兩個方向：

1  優化培養條件、誘導體系等以期獲得更穩定的iPSC細胞系；iPSC細胞呈現克隆生長，為確定不同iPSC細胞系，哪種在后續基因編輯以及誘導中更加穩定，對各個細胞系實時監測，通過匯合度計算增殖情況[7]。
 

圖1. 候選細胞系的增殖特征：
A：Incucyte® 記錄不同iPSC細胞系傳代三天后的圖片；B：3×104 個細胞接種48h細胞消化計數；C：使用Incucyte® 計算3個時間點匯合度（confluence）來評估iPSC增殖情況

2  模擬疾病模型以及分化出更成熟的成體組織細胞，包括優化誘導條件以及改為3D培養等。下面兩篇文獻的Figure展示了向神經以及心肌細胞方向的分化：
 

圖2. 體外培養20天的分化神經熒光細胞簇：
在iPSC向神經細胞分化的過程中，用βIII-tubulin (TUJ1) 對未成熟神經元的聚集體進行染色，并顯示從(a)陰性對照聚集體、(b)未加載的微球結合聚集體、(c)微球結合聚集體和(d)陽性對照聚集體[8]。Incucyte® 自動拍攝36張單獨圖像組合而成，用 ImageJ 軟件拼接和裁剪。比例尺：300 μm。
 


圖3. hiPSC-CM 實時凋亡信號檢測
心肌分化，作者利用一種新的Metabolic Selected的誘導選擇方法制備缺血性心肌病模型的心肌細胞，這種模型的心肌細胞應具備Dox毒性敏感特征。利用我們的活細胞凋亡指示劑[9]實時檢測在加入Dox后心肌細胞的死亡情況發現Annexin V+的細胞比例隨Dox濃度提升死亡比例上升。
 
 
iQue® 在iPSC研究中的應用

除Incucyte® 的應用外，高通量的研究當然少不了我們的iQue® 高通量流式細胞儀，專為大規模篩選設計。

2020年時，阿斯利康改良Crisper-cas9技術，開發了一種ObLiGaRe強力霉素誘導型SpCas9(ODInCas9)轉基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe導致人類或小鼠細胞的功能整合，最終產生ODInCas9小鼠，并且驗證發現這種小鼠體細胞體內編輯可以模擬非小細胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治療研究能夠驗證候選藥物的功效。在判斷基因編輯成功與否時，應用到Incucyte® 檢測細胞增殖，并聯合使用iQue® 及Incucyte® 篩選GFP陽性的細胞[10]。


圖4. 高通量篩選編輯成功的GFP陽性細胞：
將各種不同組織細胞以及iPSC細胞導入OdInCas9，抗生素篩選后進行單克隆挑選培養，用Incucyte® 拍照成像，識別GFP陽性細胞，為確定是否真正導入OdInCas9，加入Dox誘導GFP表達，細胞消化后放入96孔板，用我們的iQue® 鑒別GFP陽性細胞。

除此之外， 賽多利斯對兩者在iPSC中的應用做了一個簡單的示例（圖5）：
 

圖5. iPSC檢測實驗流程：
多能性檢測：iQue® 檢測iPSC細胞系多能性標記基因表達并用Incucyte® 檢測細胞形態；
2D培養時，利用Incucyte® 拍照，iQue® 檢測表面標記基因表達；
3D培養21天后，以同樣方法檢測。
 
而下圖就是一個很好的案例。
 

圖6. 優化培養基長期培養特征評估：
我們加入一種基礎培養基以及一種優化培養基培養ATCC-DYS0100 iPSC細胞系，并檢測這兩種情況下的生長狀況、形態以及標記基因表達（圖5），可以看到陰性對照（非多能細胞）THP1細胞表達高水平SSEA-1，低表達TRA-1-60，陽性對照NCCIT細胞恰恰相反（圖6 A），優化過培養基在長期培養到18天時，仍然保持著很強的多能性，而非優化培養基隨著時間推移，逐漸分化。Forecyt分析軟件特有的熱圖結果，清晰地展示18天時多能性標記基因的表達比例（圖6 B），從而方便地實現大規模篩選。Incucyte® 對培養的擬胚體進行觀察，發現優化過的細胞偏心度遠低于未優化組，更加圓潤（圖6 C,D），證明優化過的培養基對于多能性的維持作用明顯。

展望未來，利用iPSC這種理想研究工具，可從成千上萬種的藥物中，發現藥物的新靶點、新作用，乃至發現新的藥物，誘導出真正替代人體成體細胞成熟度的細胞。
 
 
為什么要用Incucyte®
長時程細胞影像分析系統？

• iPSC異質性強對培養條件要求苛刻，培養箱內可長達數周的連續觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害
• 6個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養皿，通量高
• 高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數；本文提到了使用Incucyte® 多個參數的調節，使得結果更加準確
• 大于100種優化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol；文章數大于12000篇，是長時間活細胞成像產品中最多

 
 
為什么要用
iQue® 高通量流式呢？

• 氣泡分隔的連續采樣技術，使流式細胞術進入高通量篩選(HTS)領域
• 最小樣本體積達到10uL，支持384、1536孔板采樣，96孔板只需5min
• ForeCyt軟件、比起傳統流式更簡單的使用及維護，硬件配套軟件，是高通量流式篩選必備儀器。雖然在文章中未提及iQue® 的高通量應用

Download

下載文檔
《活細胞監測：優化高級細胞模型的工作流程》

-參考文獻- 
[1]Ding M, Clark R, Bardelle C, et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective[J]. SLAS discovery: advancing life sciences R & D, 2018, 23(7): 719–731.
[2]Zhou M, Wang H, Zeng X, et al. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. The Lancet, Elsevier, 2019, 394(10204): 1145–1158.
[3]Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors[J]. Cell, 2006, 126(4): 663–676.
[4]Generation of human-induced pluripotent stem cells - PubMed[EB/OL]. /2022-09-30. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18600223/.
[5]Liu G, David B T, Trawczynski M, et al. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications[J]. Stem Cell Reviews and Reports, 2020, 16(1): 3–32.
[6]Kim J, Koo B-K, Knoblich J A. Human organoids: model systems for human biology and medicine[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21(10): 571–584.
[7]Pantazis C B, Yang A, Lara E, et al. A reference induced pluripotent stem cell line for large-scale collaborative studies[J]. bioRxiv, 2022: 2021.12.15.472643.
[8]Agbay A, Vega L D L, Nixon G, et al. Guggulsterone-releasing microspheres direct the differentiation of human induced pluripotent stem cells into neural phenotypes[J]. Biomedical Materials, IOP Publishing, 2018, 13(3): 034104.
[9]Davis J, Chouman A, Creech J, et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell–derived cardiomyocytes[J]. JCI Insight, , 6(10): e134368.
[10]Lundin A, Porritt M J, Jaiswal H, et al. ObLiGaRe doxycycline Inducible (ODIn) Cas9 system driving pre-clinical drug discovery, from design to cancer treatment[R]. Genomics, 2020.