前文我們已經介紹過，PROTAC 分子由靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接段組成，設計 PROTAC 之初，三者應該分別考量。

 

■ 靶蛋白配體

 

在實際設計工作中，往往先會選擇好目標蛋白。靶蛋白的挑選可以從以下幾點考慮：

 

1、該蛋白是否具有特異性, 非特異性蛋白會造成脫靶毒性；

2、該蛋白是否屬于 PROTAC 分子常規的降解蛋白 (PROTACable 靶點增加 PROTAC 設計的有效性), 2021 年，Nature Reviews Drug Discovery 雜志報導了一篇利用 PROTACtability 方法評價蛋白靶點的可PROTACable的文章，文章最后提出值得 PROTAC 化的靶點包括了激酶 (MEK、KRAS、CDK 和 Bcr/Abl)、轉錄因子 (如 p53、STAT、RAR、ER 和 AR)、表觀遺傳因子 (如 HDAC 和 BET 溴結構域)和 E3 連接酶本身 (如 MDM2) 等。

 

3、該蛋白是否有相關的配體或晶型報道，這是考慮到商業化設計 PROTAC 的效率性，如目前臨床二期的兩個已知結構的 ARV-471和 ARV-766 結構分別源自于 Tamoxifen 和 (+)-JQ-1。

 

 

上述三點均滿足時，常規的 PROTAC 設計便可進行：從靶點已知的相關配體分子構效關系總結出它不影響結合的適合改造的位置，或是有蛋白的晶體模型可被用于虛擬篩選從而縮小后續高通量篩選的范圍。

 

 

當然，在實際設計中，往往還會遇到靶蛋白本身的內源性配體：多肽、DNA、糖鏈等，基于此也有相關的 p-PROTAC 被開發 (多肽-PROTAC)，筆者認為基于肽段的 PROTAC 可能是該項技術發展的一個方向：目前傳統 PROTAC (小分子為主) 需要前期配體的構效關系研究以確定基礎決定連接位置，但單純用蛋白本身的多肽配體則不需要這個，大多數多肽可連接的位置在 C 端或者 N 端。

 

當然，若是從頭設計 PROTAC (沒有成熟配體報道的靶蛋白)，要考慮的就不僅僅是上述問題了，結合腔、突變、其它變構位點、可逆共價結合等種種因素都需要深入研究，總結起來則是一個藥化課題的體量。

 

■ E3 連接酶配體

首先，來看 E3 連接酶配體，對于 E3 連接酶配體目前常規使用的還是 CRBN 和 VHL 兩種配體。從流程上來講，原則上需要通過 E3 連接酶試劑盒的確定靶細胞中 E3 連接酶的豐度，從而選擇最佳的 E3 連接酶配體。但目前這一塊目前的研究涉及仍然不是很多，一般而言，商業化的設計只是選擇經濟易得的 CRBN 和 VHL 配體分子。

 

圖 3. 常見的 E3 連接酶及其配體^[6]  

 

隨著對 PROTAC 技術的深入研究，目前對 E3 泛素連接酶配體的篩選也開始進入科學家視野。在 “三元降解復合分子” 的模式下，也出現了比如基于 RNA 酶的 RIBOTAC (其功能是將目標 RNA “帶到” RNase進行降解)、基于溶酶體的 ATTEC (既可以與自噬過程中的關鍵蛋白 LC3 結合，也可以與靶蛋白結合，將靶蛋白綁定至自噬小體進行降解)、LYTAC（干貨丨藥界新寵—— LYTAC 與靶向蛋白降解技術) 和自噬介導的降解劑 AUTAC 等，它們補充了 PROTAC 的降解范圍，使靶向降解可以作用于更多方面。結構上設計思路不變，只是對 E3 連接酶配體做相應的替換。

 

圖 4. 利用 RNA 酶靶向降解 ROI 的 RIBOTAC^[7]

a. RIBOTAC 是一個二價分子，包含 RNA 結合模塊 (紫色)，核糖核酸酶 (RNase) 招募模塊(藍色)和一個連接子 (粉線); RIBOTAC一旦與靶 RNA 結合，就會在靶 RNA 附近招募 RNase，從而促進其降解。b. PROTAC 降解機制。

 

■ Linker 分子

最后讓我們看看看似簡單的 Linker 分子。初步的 PROTAC 設計常常會選擇 PEG 鏈作為連接分子。PEG 鏈具有足夠的柔性，可以調整分子到適宜的結合角度，但也正由于 PEG 鏈的柔性，讓分子的結合熵過高，這一點在后期的優化中需要將之改善。

 

Linker 的設計目前沒有成熟的方案，通過對目前報道和臨床已知的 PROTAC 統計，大部分 Linker 所用原子的鏈長常在 10~20 個原子長度。另外也有研究通過歸一化分析，總結了鏈長與降解活性的關系，從下圖中大致可以看出：較長的鏈長由于更高的熵而使活性降低，但相較于較低鏈長導致的無法有效拉近配體兩端分子距離這一結果，它的影響較小。所以分子設計初期一般會選擇稍長的 Linker 鏈。

 

 

具體問題需要具體分析，Linker 的選擇不但與蛋白結合域的深度相關，也會對配體與蛋白的結合以及整體 PROTAC 的物理性質造成影響。在 PROTAC 的后期優化中，它往往是考察的重點。

 

誠然，經過以上幾步合理設計后雖然可以初步構建一個 PROTAC 分子，但它并不一定具有活性，任何藥物的設計都不是一蹴而就，而是實驗驗證與總結設計螺旋上升的過程。在后期的結構優化分析原因時，仍然需要綜合考量每一步設計中選擇的分子、連接位點的合理性以及整體 PROTAC 的透膜性等問題。

 

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PROTAC

dBET6 是一種高效的，選擇性的，細胞透過的基于 PROTAC 技術的 BET 降解劑，IC50 值為 14 nM，具有抗腫瘤活性。

PROTAC K-Ras Degrader-1 是一種基于 PROTAC 技術的有效的 K-Ras 降解劑，在 SW1573 中對 K-Ras 降解率 ≥ 70%。

SNIPER

SNIPER (BRD)-1 由 IAP 拮抗劑 LCL-161 衍生物和 BET 抑制劑 (+)-JQ-1，通過 linker 連接組成，誘導 BRD4 降解。SNIPER (BRD)-1 同時抑制 cIAP1，cIAP2 和 XIAP，IC50 分別為 6.8 nM，17 nM 和 49 nM。

SNIPER (ABL)-020 由 Dasatinib (ABL 抑制劑) 通過 linker 與 Bestatin (cIAP1 配體) 組合而成，可有效降解 BCR-ABL 蛋白。

Protac-linker conjugate for PAC

PROTAC BRD4 Degrader-5-CO-PEG3-N3 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯物，包含 BRD4 降解劑 GNE-987 和 3 個 PEG 的 linker。

PAC 由 ADC linker 和 PROTAC 分子組成，PAC 與抗體偶聯。與 PROTAC (不偶聯 Ab) 相比，PAC 偶聯抗體之后更加顯著降低雌激素受體-α (ERα) 水平。

PROTAC BRD4 degrader for PAC-1 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯物，包含嵌合體 BET 降解劑 GNE-987 和含二硫化物的 linker。

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參考文獻

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3. Schneider M, Radoux CJ, Hercules A, Ochoa D, Dunham I, Zalmas LP, Hessler G, Ruf S, Shanmugasundaram V, Hann MM, Thomas PJ, Queisser MA, Benowitz AB, Brown K, Leach AR. The PROTACtable genome. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul 20; 20:789-797.
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7. Costales MG, Suresh B, Vishnu K, Disney MD. Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA. Cell Chem Biol. 2019 Aug 15;26(8):1180-1186.e5.

8. Bemis TA, La Clair JJ, Burkart MD. Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J Med Chem. 2021 Jun 24;64(12):8042-8052.