培養基作為細胞的“食物”，是細胞培養和發酵的基礎，大腸桿菌在不同的培養基中培養可能會表現出不同的性狀，而利用這些性狀的不同，可將部分菌種進行區分或分離，此外，根據目標菌種選擇合適的培養基可以低成本、穩定的高表達。

大腸桿菌分離培養基常見的主要有以下幾種：

大腸桿菌分離培養基：主要根據不同的大腸桿菌在培養基中的生產速度，代謝產物，對培養基中特定組分的需求利用情況不同等實現對不同種類的菌種進行分離或篩選。

LB固體培養基：是一種主要組分為酵母提取物、胰化蛋白胨、NaCl瓊脂的非選擇性固體培養基，通常用于細菌的培養。LB中加入的瓊脂使培養基形成固體凝膠狀態，細菌在其表面生長。向LB固體凝膠中添加特定的抗生素（如氨芐青霉素、卡那霉素等），可以選擇性培養對該抗生素耐受的菌株并將非耐受的菌株去除，菌體對抗生素耐受的原因是由菌體質粒中含有抗生素抗藥基因所賦予的。如：在制備大腸桿菌DH5α感受態細胞的過程中，添加氨芐青霉素的LB培養基可作為篩選含氨芐青霉素基因質粒的大腸桿菌。

伊紅美藍固體培養基（EMB）：是一種主要組分為蛋白胨，乳糖。磷酸氫二鈉鈉，瓊脂伊紅，美蘭的用于大腸桿菌和產氣腸桿菌的分離和鑒別的培養基，也適用于大腸菌群的分離培養，為弱選擇性培養基。各成分的作用為：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖提供碳源；磷酸氫二鉀是緩沖劑；瓊脂是凝固劑；伊紅（Eosin Y）為酸性染料：美蘭（eosin-methylene blue）為堿性染料，二者在培養基中作為指示劑。當大腸桿菌分解乳糖產酸時，細菌帶正電，被伊紅染上紅色，再與美蘭結合而形成紫黑色菌落，帶有金屬光澤；若是產氣腸桿菌形成棕色菌落，并很少有金屬光澤；若是不能分解乳糖的細菌，如沙門氏菌和志賀氏菌，則形成無色或琥珀色半透明菌落；白色念珠菌形成蛛絲狀或羽毛狀菌落，凝固酶陽性葡萄球菌形成無色針尖大小的菌落。

麥康凱固體培養基（MAC）：是一種主要用來檢驗分離腸道菌的培養基，在藥典中規定可以用于大腸桿菌的檢測，在食品標準中可用于腸道致病菌的分離。培養基中膽鹽及結晶紫對大多數革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，大腸桿菌因為可以發酵乳糖產酸，在培養基上菌落呈現為桃紅色，并且菌落周圍通常有明顯的沉淀環，大腸菌群同樣能發酵乳糖產酸，菌落也呈桃紅色。致病性的腸道菌（如志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌等）因不發酵乳糖，菌落呈無色。此培養基由于對大腸桿菌的專一性較弱（大腸菌群和大腸桿菌的菌落特征比較接近），若樣品中大腸菌群的含量比較高，分離大腸桿菌的效果較差。

大腸桿菌顯色固體培養基（TBX）：利用酶底物法原理，對于大腸桿菌的分離和計數有高度的特異性，大腸桿菌特有的β-葡萄糖醛酸苷酶可分解培養基中的底物，使菌落呈藍綠色，而大腸菌群和其他大多數雜菌通常呈無色或其他顏色，革蘭氏陽性菌大多數不生長。在干擾菌較多的情況下，顯色培養基的分離率遠高于其它培養基。但是該培養基價格較高，有極少數大腸桿菌不產生β-葡萄糖醛酸苷酶（如腸出血性大腸埃希氏菌O157菌），因此不能顯色。此培養基適用于食品、水、環境等檢測。

哥倫比亞MUG固體培養基：利用大腸桿菌可利用β-葡萄糖醛酸苷酶特異性分解MUG，在紫外燈照射下發出熒光，該培養基特異性較強，極少數不產生β-葡萄糖醛酸苷酶的大腸桿菌不能發出熒光。此培養基沒有選擇性，多數雜菌均能生長，通常用于含菌量較少的水中的大腸桿菌計數。

VRBA-MUG固體培養基：在VRBA基礎上添加了MUG，相比較于哥倫比亞MUG固體培養基，該培養基具有選擇性，能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長，大腸桿菌和大腸菌群可在此培養基中生長呈紫紅色菌落，周圍有沉淀環，因為添加了MUG，在紫外燈下照射時，大腸桿菌菌落可發出熒光，而大腸菌群則沒有熒光。此培養基一般用于食品中大腸桿菌的檢驗和計數。
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