高通量測序后的下游實驗驗證方法之m6A RNA甲基化篇
此前，我們分享了m6A RNA甲基化研究的數據挖掘思路，進而篩選出m6A修飾目標基因。
做完MeRIP-seq測序后，如果需要對分析結果中感興趣的內容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。m6A RNA甲基化修飾目標基因的進一步驗證或后期試驗包括以下6個方面：
（1）簡單驗證
A. 目標基因m6A甲基化的驗證：MeRIP-RT-PCR
B. 檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
C. 檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標基因表達和細胞功能
A. m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過表達、m6A甲基化抑制劑
如環亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2
B. 檢測m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點雜交（定性）、比色法（定量）、質譜法（定量）
C. 檢測目標基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
D. 檢測目標基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 檢測目標基因蛋白質水平：Western blot
F. 檢測細胞功能/表型變化
（3）靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區域m6A修飾是否真的影響目標基因的表達
A. 目的基因m6A甲基化干擾細胞系的構建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）——構建含甲基化/未甲基化m6A位點的目標基因-熒光素酶表達質粒，轉染細胞并表達。
B. 檢測目標基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
C. 檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
D. 檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
E. 檢測細胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標志物測定... ...
用于驗證目標基因上m6A甲基化功能的雙熒光素酶報告系統
（4）研究目標基因的m6A甲基化如何影響目標基因表達
A. 檢測m6A是否通過影響目標基因翻譯而影響蛋白質水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過對結合核糖體上的mRNA進行定量，分析目標基因的蛋白翻譯效率
Polysome Profiling方法舉例：
siMETTL3/14對目標基因與與核糖體的結合造成影響，對內參基因GAPDH無影響。
B. 研究m6A是否通過調節mRNA的穩定性和降解而影響目標基因蛋白水平
研究m6A對目標基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR和RNA-seq檢測目標基因的mRNA水平是否收到影響
C. 研究m6A是否通過調控RNA的出核（nuclear export）而影響目標基因蛋白水平
裂解細胞，超速離心分離細胞核與細胞質，然后分別進行RT-PCR實驗檢測細胞核與細胞質中的mRNA水平
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR檢測目標基因在細胞核與細胞質中的mRNA水平是否受到影響
（5）m6A修飾目標基因的表達回復實驗
A. writers的突變/敲降/敲除實驗：
RT-PCR檢測目標基因的mRNA水平變化
Western blot檢測目標基因的蛋白水平變化
檢測目標基因的功能
B. writers的突變/敲降/敲除后，目標基因的過表達回復實驗：
檢測各項表型指數、細胞增殖、分化的回復情況
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表達受到影響。而靶基因Ezh2過表達回復實驗會消除METTL3敲除對細胞增殖分化的不利影響
（6）研究特定m6A Readers通過結合目標基因RNA而影響目標基因的蛋白表達
YTHDF1引入突變后，檢測其假定靶基因的表達和與靶基因的結合是否受到影響
做完MeRIP-seq測序后，如果需要對分析結果中感興趣的內容進行后期驗證，則需要進行下游實驗設計。m6A RNA甲基化修飾目標基因的進一步驗證或后期試驗包括以下6個方面：
- 簡單驗證
- 全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標基因表達和細胞功能
- 靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區域m6A修飾是否真的影響目標基因的表達
- 研究目標基因的m6A甲基化如何影響目標基因表達
- m6A修飾目標基因的表達回復實驗
- 研究特定m6A Readers通過結合目標基因RNA而影響目標基因的蛋白表達
（1）簡單驗證
A. 目標基因m6A甲基化的驗證：MeRIP-RT-PCR
B. 檢測目標基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
C. 檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干擾實驗（非靶向），驗證m6A甲基化書否真的影響目標基因表達和細胞功能
A. m6A甲基化干擾：m6A writers/erasers的突變/敲降/敲除/過表達、m6A甲基化抑制劑
如環亮氨酸、m6A去甲基化抑制劑如FTO抑制劑FB23-2
B. 檢測m6A甲基化整體變化：m6A甲基化免疫熒光染色（定性）、m6A斑點雜交（定性）、比色法（定量）、質譜法（定量）
C. 檢測目標基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
D. 檢測目標基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 檢測目標基因蛋白質水平：Western blot
F. 檢測細胞功能/表型變化
FB23-2給藥后，大腦損傷組神經功能缺陷評分顯著變差
（3）靶向目標基因的甲基化/去甲基化實驗，檢測某區域m6A修飾是否真的影響目標基因的表達
A. 目的基因m6A甲基化干擾細胞系的構建：熒光素酶活性分析實驗（Luciferase activity assay）——構建含甲基化/未甲基化m6A位點的目標基因-熒光素酶表達質粒，轉染細胞并表達。
B. 檢測目標基因的m6A甲基化變化：MeRIP-qPCR
C. 檢測熒光素酶報告基因的mRNA表達水平：RT-qPCR
D. 檢測目標基因蛋白質表達水平：Western blot
E. 檢測細胞功能受到的影響：免疫熒光顯微觀察、功能標志物測定... ...
用于驗證目標基因上m6A甲基化功能的雙熒光素酶報告系統
（4）研究目標基因的m6A甲基化如何影響目標基因表達
A. 檢測m6A是否通過影響目標基因翻譯而影響蛋白質水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通過對結合核糖體上的mRNA進行定量，分析目標基因的蛋白翻譯效率
通過對結合核糖體上的mRNA進行定量，分析目標基因的蛋白翻譯效率
Polysome Profiling方法舉例：
siMETTL3/14對目標基因與與核糖體的結合造成影響，對內參基因GAPDH無影響。
B. 研究m6A是否通過調節mRNA的穩定性和降解而影響目標基因蛋白水平
研究m6A對目標基因mRNA水平的影響
RT-qPCR
RNA-seq
C. 研究m6A是否通過調控RNA的出核（nuclear export）而影響目標基因蛋白水平
裂解細胞，超速離心分離細胞核與細胞質，然后分別進行RT-PCR實驗檢測細胞核與細胞質中的mRNA水平
METTL3/14干擾后，采用RT-PCR檢測目標基因在細胞核與細胞質中的mRNA水平是否受到影響（5）m6A修飾目標基因的表達回復實驗
A. writers的突變/敲降/敲除實驗：
RT-PCR檢測目標基因的mRNA水平變化
Western blot檢測目標基因的蛋白水平變化
檢測目標基因的功能
B. writers的突變/敲降/敲除后，目標基因的過表達回復實驗：
檢測各項表型指數、細胞增殖、分化的回復情況
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表達受到影響。而靶基因Ezh2過表達回復實驗會消除METTL3敲除對細胞增殖分化的不利影響
（6）研究特定m6A Readers通過結合目標基因RNA而影響目標基因的蛋白表達
- 合理推測結合目標基因的m6A Readers是哪一種
- Readers的突變/敲降/敲除/過表達實驗：
- 驗證靶基因的mRNA水平
- 的RIP-qPCR驗證Readers蛋白與靶基因mRNA的結合
YTHDF1引入突變后，檢測其假定靶基因的表達和與靶基因的結合是否受到影響
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