表觀遺傳時鐘（甲基化年齡）在衰老和腫瘤中的作用
早在2018年，加州大學洛杉磯分校生物統計學家Steve Horvath研究發現：隨著年齡的增加，某些基因的甲基化增加了，而另一些基因的甲基化會減少，處于浮動狀態。在此基礎上他設計開發了表觀遺傳時鐘（Epigenetic clock），即利用基因的甲基化圖譜來判斷生理年齡，且精確度高達98%。本期我們通過3篇研究論文說說表觀遺傳時鐘（或DNA甲基化年齡）的作用，它和衰老相關，也和癌癥高度相關。
01 小鼠：表觀遺傳時鐘與衰老
標題：Tick tock, tick tock: Mouse culture and tissue aging captured by an epigenetic clock.
期刊：Aging Cell
影響因子:IF 9.304
發表時間：2022.01.25
技術平臺：RRBS
摘要：
衰老與DNA甲基化的動態變化相關，盡管這種變化的前因后果尚不清楚，通過體外模型研究控制這些變化，可以從實驗中大大提高揭示表觀遺傳衰老機制的能力。然而目前尚不清楚培養細胞引起的變化是否可以作為體內衰老組織中觀察到的模型。為此作者對小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）傳代培養并通過簡化代表性重亞硫酸鹽測序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）評估每個階段的DNA甲基化水平變化。此外，作者開發一種被稱為“CultureAGE”的體外追蹤細胞衰老方法，檢測能否追蹤各種小鼠組織的生理衰老，以及抗衰老干預能否調控這種追蹤方法。結果顯示，隨著年齡的增長，多個組織（肝、肺、腎、血液和脂肪）中CultureAGE值顯著增加。且通過對照驗證CultureAGE值不是細胞衰老的標志物，表明CultureAGE揭示了一種可以在體外誘導的獨特但漸進的細胞衰老現象。此外研究還證明，當MEFs重編程為誘導多能干細胞（iPSCs）時，在熱量限制的動物中表觀遺傳衰老速度較慢。富集和聚類分析表明，EED和PcGs（Polycomb group）蛋白是翻譯culture aging表型中潛在的重要染色質調控因子�？傊狙芯孔C實可以體外誘導生理相關衰老變化，并揭示表觀遺傳衰老機制。
實驗方法：
在兩只雌性小鼠妊娠第12.5天提取分離MEF細胞。將細胞進行分裂/傳代培養六次，每次傳代均進行流式細胞術/共聚焦顯微鏡和RRBS測序。通過RRBS在三個生物重復的每次傳代中評估DNA甲基化變化。
圖1：在MEF中測定DNA甲基化CultureAGE值
（a）在常氧（20%O2）狀態下對MEF培養，直至細胞終末停滯狀態（細胞衰老），其復制能力逐漸降低。（b）RRBS測序的DNA甲基化數據中產生CultureAGE，隨后在衰老活體隊列中進行生理相關性測試。
（c）紅色=MEF1細胞系，藍色=MEF2細胞系，綠色=MEF3細胞系重復驗證。利用皮爾遜相關系數分析法確定通路相關性和統計顯著性。
關鍵圖形：
CultureAGE表型獨立于細胞衰老表型，需要復制擴增
聚類分析證實culture aging存在于生理環境中，并強調PcG蛋白是重要的culture aging調控因子
02 F344大鼠：表觀遺傳時鐘與大顆粒淋巴細胞白血病
標題：Impact of Large Granular Lymphocyte Leukemia on Blood DNA Methylation and Epigenetic Clock Modeling in Fischer 344 Rats
期刊：J Gerontol A Biol Sci Med Sci
影響因子：IF 6.053
發表時間：2021.10.28
技術平臺：RRBS
摘要：
特定CpG位點的甲基化年齡依賴性差異已在“表觀遺傳時鐘”公式中用以預測年齡。表觀遺傳年齡與實際年齡的偏差情況與不良健康結果相關，有助于了解健康狀況。在大多數情況下，表觀遺傳時鐘通過從循環血細胞中提取DNA進行甲基化水平評估。然而，表觀遺傳時鐘對循環腫瘤細胞的影響尚不清楚。本研究使用常發生大顆粒淋巴細胞白血病（LGLL）的61只17-27個月大的Fischer 344（F344）大鼠為樣本，檢測在27只大鼠的脾臟和肝臟中發現明確的LGLL病理學標記。作者利用覆蓋300萬個CpG位點的簡化甲基化測序（RRBS）來評估DNA甲基化。盡管LGLL廣泛增加DNA甲基化的變異性，但并沒有改變表觀遺傳衰老狀態。將LGLL大鼠納入時鐘訓練集，結果顯著改變了121個常用CPG位點中的83個預測因子。此外在包含LGLL的大鼠樣本上的訓練模型比不含LGLL的訓練模型具有更大的絕對年齡差（增加39%；p<0.0001）。表明衰老和LGLL的表觀遺傳學信號不同，因此LGLL評估不是F344大鼠中表觀遺傳年齡的必需有效測定，不過表觀遺傳時鐘公式的精度和結構可能會受到訓練集中腫瘤造血細胞的影響。
實驗方法：
該研究共使用162只雄性F344 CDF大鼠（1-27個月，每個月齡6只）。將大鼠單獨飼養，可隨意攝入標準的室內食物和水，并保持12小時開燈-12小時關燈循環。評估LGLL的大鼠在抽血后4周內進行安樂死，解剖內部器官并儲存在中性緩沖的10%福爾馬林中用于隨后的病理學分析。此前研究表明在18月齡之前存在 LGLL 極為罕見，因此本研究只評估17-27月齡大鼠 (n = 61) 的 LGLL 病理學，并評估六只 6月齡大鼠和六只 12月齡大鼠的脾臟和肝臟病理學作為陰性對照。提取大鼠血液DNA進行簡化甲基化測序（RRBS）和高性能統計分析。
結果：
LGLL病理學
LGLL相關的DNA甲基化水平變化
LGLL對表觀遺傳鐘的影響
03 人樣本：乳腺癌與復制相關的表觀遺傳時鐘
標題：DNA methylation landscapes of 1538 breast cancers reveal a replication-linked clock, epigenomic instability and cis-regulation.
期刊：nature communications
影響因子: IF 14.919
發表時間：2021.09.13
技術平臺：RRBS
摘要：
DNA甲基化在癌癥中是異常的，但這種表觀遺傳學變化的動力學作用、調控作用和臨床意義仍然知之甚少。
METABRIC隊列中包含了2000多個乳腺癌樣本，這些樣本此前已在臨床、遺傳和轉錄方面進行了廣泛表征。本文作者使用RRBS測序分析技術對其DNA甲基化狀態進行研究。來自METABRIC隊列的1538例乳腺癌組織和244個相鄰正常乳腺組織的簡化甲基化測序（RRBS）譜，在豐富的基因組、轉錄組和臨床數據背景下對DNA甲基化進行深度分析。來自免疫和間質標記物的腫瘤DNA甲基化狀態被反褶積（deconvoluted），從而導致在非CpG位點發現與全基因組甲基化丟失的腫瘤復制相關時鐘（replication-linked clock）。出乎意料的是，在大部分CpG區域甲基化遵循兩個獨立于復制的獲得（MG）或丟失（ML）過程，稱之為表觀基因組不穩定性，表觀基因組不穩定性與腫瘤分級/分期、TP53突變和較差預后相關。另外，研究人員在數百個啟動子和數千個遠端元件中發現了順式特異性甲基化（cis-specific methylation）和表達相關，包括一些已知的腫瘤抑制因子和致癌基因，證明了數百個啟動子和數千個遠端元件中的甲基化水平和特異性順式作用下的基因表達相關，突出了全基因組甲基化水平變化在腫瘤轉錄改變中的重要作用，包括典型的BRCA1高甲基化效應。
實驗方法：
從METABRIC數據庫中選取1538個原發性乳腺癌組織樣本和244個相鄰組織的正常樣本，共1782個樣本進行簡化DNA甲基化測序分析（RRBS），并建立導致乳腺癌DNA甲基化過程的多因素統一模型。
結果：
乳腺癌與復制相關的DNA甲基化時鐘過程相關
1.METABRIC 隊列的甲基化分析
從METABRIC隊列中選取1538個原發性乳腺癌組織樣本和244個相鄰組織的正常樣本，利用可獲得的臨床、基因組和轉錄組數據來分析甲基化過程（圖1a），研究人員利用RRBS測序方法對這1782個樣本以30.4B reads來覆蓋廣泛的基因組分布，有助于分析全基因組甲基化變化趨勢及調控元件和啟動子的甲基化變化。RRBS測序方法使93%的樣本被超過1 M CpG位點的10個以上reads覆蓋(圖1b)，9%的reads被映射到真正的啟動子區域（圖1c）,75%的啟動子區域平均覆蓋超過20個reads（平均覆蓋246個），有助于下游的定量分析（圖1d）。
2.乳腺癌甲基化的分層建模
以METABRIC數據庫為模型，研究人員開發了一種半監督算法（Methylayer），用于腫瘤甲基化動力學的分層建模（圖1e）。Methylayer的基本原理依賴于基因表達、遺傳學和臨床信息的整合，計算混雜因素（腫瘤微環境[TME]效應），以此推斷可隨機影響全基因組甲基化變化趨勢，Methylayer可以強有力地篩選表觀遺傳順式調控的候選基因，并得出預后指標。將Methylayer分別應用于METABRIC隊列的ER+和ER-腫瘤樣本，并比較兩類腫瘤樣本的動力學。
數據結果發現，基因表達的整合使Methyllayer將TME效應識別為主要數據混雜因素，從而促進從腫瘤活檢中獲得的甲基化圖譜多樣化（圖1f）。該算法在基因表達和啟動子甲基化狀態的相互關聯中檢測到一個強大的免疫標記，即TME標記與腫瘤分級相關(圖1g)，并通過獨立的反褶積表達譜和病理指標進行驗證。在對TME標記進行推斷之后，研究人員應用了一種新的K-nn歸一化算法(K-nn normalization algorithm Methods，圖1h)，該算法在推斷下游腫瘤甲基化區域時，驗證了Methyllayer顯著降低了TME偏差。
3. 復制相關的甲基化時鐘過程與腫瘤中甲基化丟失相關
與對照組相比，基于TME標準甲基化的Methyllayer聚類在腫瘤樣本中鑒定出一組高度相關的CpG區域 (圖1i)，這一甲基化區域與腫瘤分級不相關(圖1j)，將其標記為時鐘層（clock layer），盡管與啟動子相關的遠端定位相關，但時鐘層CpG顯示出較低的CpG含量(圖1k),因此在推定的調控元件（基于組蛋白修飾）中代表性不足。
基因組通過定義早期和晚期復制域的調控過程在S期復制。有趣的是，在S晚期復制域中，時鐘層的腫瘤甲基化減少更為強烈（圖1l,m）。這與此前研究一致，表明衰老和癌癥中DNA甲基化的丟失可能與復制過程中相關的甲基化異常積累（“epi-mutations”,表突變）相關。篩選跨METABRIC的基因表達特征并未發現與甲基化時鐘層相關的常規轉錄程序�？傊�，這些數據共同表明癌癥中甲基化丟失時鐘的動力學與基因組復制過程密切相關。
參考文獻：
DOI:10.1111/acel.13553
DOI:10.1093/gerona/glab328
DOI:10.1038/s41467-021-25661-w
01 小鼠：表觀遺傳時鐘與衰老
標題：Tick tock, tick tock: Mouse culture and tissue aging captured by an epigenetic clock.
期刊：Aging Cell
影響因子:IF 9.304
發表時間：2022.01.25
技術平臺：RRBS
摘要：
衰老與DNA甲基化的動態變化相關，盡管這種變化的前因后果尚不清楚，通過體外模型研究控制這些變化，可以從實驗中大大提高揭示表觀遺傳衰老機制的能力。然而目前尚不清楚培養細胞引起的變化是否可以作為體內衰老組織中觀察到的模型。為此作者對小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）傳代培養并通過簡化代表性重亞硫酸鹽測序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）評估每個階段的DNA甲基化水平變化。此外，作者開發一種被稱為“CultureAGE”的體外追蹤細胞衰老方法，檢測能否追蹤各種小鼠組織的生理衰老，以及抗衰老干預能否調控這種追蹤方法。結果顯示，隨著年齡的增長，多個組織（肝、肺、腎、血液和脂肪）中CultureAGE值顯著增加。且通過對照驗證CultureAGE值不是細胞衰老的標志物，表明CultureAGE揭示了一種可以在體外誘導的獨特但漸進的細胞衰老現象。此外研究還證明，當MEFs重編程為誘導多能干細胞（iPSCs）時，在熱量限制的動物中表觀遺傳衰老速度較慢。富集和聚類分析表明，EED和PcGs（Polycomb group）蛋白是翻譯culture aging表型中潛在的重要染色質調控因子�？傊狙芯孔C實可以體外誘導生理相關衰老變化，并揭示表觀遺傳衰老機制。
實驗方法：
在兩只雌性小鼠妊娠第12.5天提取分離MEF細胞。將細胞進行分裂/傳代培養六次，每次傳代均進行流式細胞術/共聚焦顯微鏡和RRBS測序。通過RRBS在三個生物重復的每次傳代中評估DNA甲基化變化。
圖1：在MEF中測定DNA甲基化CultureAGE值
（c）紅色=MEF1細胞系，藍色=MEF2細胞系，綠色=MEF3細胞系重復驗證。利用皮爾遜相關系數分析法確定通路相關性和統計顯著性。
關鍵圖形：
CultureAGE表型獨立于細胞衰老表型，需要復制擴增
通過CultureAGE測定多組織生理衰老模式
CultureAGE預測熱量限制小鼠和重編程的MEF細胞培養狀態
02 F344大鼠：表觀遺傳時鐘與大顆粒淋巴細胞白血病
標題：Impact of Large Granular Lymphocyte Leukemia on Blood DNA Methylation and Epigenetic Clock Modeling in Fischer 344 Rats
期刊：J Gerontol A Biol Sci Med Sci
影響因子：IF 6.053
發表時間：2021.10.28
技術平臺：RRBS
摘要：
特定CpG位點的甲基化年齡依賴性差異已在“表觀遺傳時鐘”公式中用以預測年齡。表觀遺傳年齡與實際年齡的偏差情況與不良健康結果相關，有助于了解健康狀況。在大多數情況下，表觀遺傳時鐘通過從循環血細胞中提取DNA進行甲基化水平評估。然而，表觀遺傳時鐘對循環腫瘤細胞的影響尚不清楚。本研究使用常發生大顆粒淋巴細胞白血病（LGLL）的61只17-27個月大的Fischer 344（F344）大鼠為樣本，檢測在27只大鼠的脾臟和肝臟中發現明確的LGLL病理學標記。作者利用覆蓋300萬個CpG位點的簡化甲基化測序（RRBS）來評估DNA甲基化。盡管LGLL廣泛增加DNA甲基化的變異性，但并沒有改變表觀遺傳衰老狀態。將LGLL大鼠納入時鐘訓練集，結果顯著改變了121個常用CPG位點中的83個預測因子。此外在包含LGLL的大鼠樣本上的訓練模型比不含LGLL的訓練模型具有更大的絕對年齡差（增加39%；p<0.0001）。表明衰老和LGLL的表觀遺傳學信號不同，因此LGLL評估不是F344大鼠中表觀遺傳年齡的必需有效測定，不過表觀遺傳時鐘公式的精度和結構可能會受到訓練集中腫瘤造血細胞的影響。
實驗方法：
該研究共使用162只雄性F344 CDF大鼠（1-27個月，每個月齡6只）。將大鼠單獨飼養，可隨意攝入標準的室內食物和水，并保持12小時開燈-12小時關燈循環。評估LGLL的大鼠在抽血后4周內進行安樂死，解剖內部器官并儲存在中性緩沖的10%福爾馬林中用于隨后的病理學分析。此前研究表明在18月齡之前存在 LGLL 極為罕見，因此本研究只評估17-27月齡大鼠 (n = 61) 的 LGLL 病理學，并評估六只 6月齡大鼠和六只 12月齡大鼠的脾臟和肝臟病理學作為陰性對照。提取大鼠血液DNA進行簡化甲基化測序（RRBS）和高性能統計分析。
結果：
LGLL病理學
按年齡劃分的大鼠 LGLL 患病率
LGLL相關的DNA甲基化水平變化
LGLL大鼠CpG甲基化的變異性增加
LGLL對表觀遺傳鐘的影響
LGLL降低了表觀遺傳時鐘精度，不會加速表觀遺傳衰老
LGLL影響表觀遺傳時鐘生成過程中的預測因子選擇
03 人樣本：乳腺癌與復制相關的表觀遺傳時鐘
標題：DNA methylation landscapes of 1538 breast cancers reveal a replication-linked clock, epigenomic instability and cis-regulation.
期刊：nature communications
影響因子: IF 14.919
發表時間：2021.09.13
技術平臺：RRBS
摘要：
DNA甲基化在癌癥中是異常的，但這種表觀遺傳學變化的動力學作用、調控作用和臨床意義仍然知之甚少。
METABRIC隊列中包含了2000多個乳腺癌樣本，這些樣本此前已在臨床、遺傳和轉錄方面進行了廣泛表征。本文作者使用RRBS測序分析技術對其DNA甲基化狀態進行研究。來自METABRIC隊列的1538例乳腺癌組織和244個相鄰正常乳腺組織的簡化甲基化測序（RRBS）譜，在豐富的基因組、轉錄組和臨床數據背景下對DNA甲基化進行深度分析。來自免疫和間質標記物的腫瘤DNA甲基化狀態被反褶積（deconvoluted），從而導致在非CpG位點發現與全基因組甲基化丟失的腫瘤復制相關時鐘（replication-linked clock）。出乎意料的是，在大部分CpG區域甲基化遵循兩個獨立于復制的獲得（MG）或丟失（ML）過程，稱之為表觀基因組不穩定性，表觀基因組不穩定性與腫瘤分級/分期、TP53突變和較差預后相關。另外，研究人員在數百個啟動子和數千個遠端元件中發現了順式特異性甲基化（cis-specific methylation）和表達相關，包括一些已知的腫瘤抑制因子和致癌基因，證明了數百個啟動子和數千個遠端元件中的甲基化水平和特異性順式作用下的基因表達相關，突出了全基因組甲基化水平變化在腫瘤轉錄改變中的重要作用，包括典型的BRCA1高甲基化效應。
實驗方法：
從METABRIC數據庫中選取1538個原發性乳腺癌組織樣本和244個相鄰組織的正常樣本，共1782個樣本進行簡化DNA甲基化測序分析（RRBS），并建立導致乳腺癌DNA甲基化過程的多因素統一模型。
結果：
乳腺癌與復制相關的DNA甲基化時鐘過程相關
1.METABRIC 隊列的甲基化分析
從METABRIC隊列中選取1538個原發性乳腺癌組織樣本和244個相鄰組織的正常樣本，利用可獲得的臨床、基因組和轉錄組數據來分析甲基化過程（圖1a），研究人員利用RRBS測序方法對這1782個樣本以30.4B reads來覆蓋廣泛的基因組分布，有助于分析全基因組甲基化變化趨勢及調控元件和啟動子的甲基化變化。RRBS測序方法使93%的樣本被超過1 M CpG位點的10個以上reads覆蓋(圖1b)，9%的reads被映射到真正的啟動子區域（圖1c）,75%的啟動子區域平均覆蓋超過20個reads（平均覆蓋246個），有助于下游的定量分析（圖1d）。
2.乳腺癌甲基化的分層建模
以METABRIC數據庫為模型，研究人員開發了一種半監督算法（Methylayer），用于腫瘤甲基化動力學的分層建模（圖1e）。Methylayer的基本原理依賴于基因表達、遺傳學和臨床信息的整合，計算混雜因素（腫瘤微環境[TME]效應），以此推斷可隨機影響全基因組甲基化變化趨勢，Methylayer可以強有力地篩選表觀遺傳順式調控的候選基因，并得出預后指標。將Methylayer分別應用于METABRIC隊列的ER+和ER-腫瘤樣本，并比較兩類腫瘤樣本的動力學。
數據結果發現，基因表達的整合使Methyllayer將TME效應識別為主要數據混雜因素，從而促進從腫瘤活檢中獲得的甲基化圖譜多樣化（圖1f）。該算法在基因表達和啟動子甲基化狀態的相互關聯中檢測到一個強大的免疫標記，即TME標記與腫瘤分級相關(圖1g)，并通過獨立的反褶積表達譜和病理指標進行驗證。在對TME標記進行推斷之后，研究人員應用了一種新的K-nn歸一化算法(K-nn normalization algorithm Methods，圖1h)，該算法在推斷下游腫瘤甲基化區域時，驗證了Methyllayer顯著降低了TME偏差。
3. 復制相關的甲基化時鐘過程與腫瘤中甲基化丟失相關
與對照組相比，基于TME標準甲基化的Methyllayer聚類在腫瘤樣本中鑒定出一組高度相關的CpG區域 (圖1i)，這一甲基化區域與腫瘤分級不相關(圖1j)，將其標記為時鐘層（clock layer），盡管與啟動子相關的遠端定位相關，但時鐘層CpG顯示出較低的CpG含量(圖1k),因此在推定的調控元件（基于組蛋白修飾）中代表性不足。
基因組通過定義早期和晚期復制域的調控過程在S期復制。有趣的是，在S晚期復制域中，時鐘層的腫瘤甲基化減少更為強烈（圖1l,m）。這與此前研究一致，表明衰老和癌癥中DNA甲基化的丟失可能與復制過程中相關的甲基化異常積累（“epi-mutations”,表突變）相關。篩選跨METABRIC的基因表達特征并未發現與甲基化時鐘層相關的常規轉錄程序�？傊�，這些數據共同表明癌癥中甲基化丟失時鐘的動力學與基因組復制過程密切相關。
圖: 在 METABRIC 隊列中解剖腫瘤、免疫學和 CAF 甲基化
參考文獻：
DOI:10.1111/acel.13553
DOI:10.1093/gerona/glab328
DOI:10.1038/s41467-021-25661-w
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