植物逆境脅迫響應的表觀遺傳調控機制介紹（抗干旱+耐高溫+抗干耐鹽）
大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。本期我們聚焦植物逆境脅迫響應的表觀遺傳調控機制。
DNA甲基化在對環境刺激的反應中起著至關重要的作用。植物DNA甲基化會隨著各種非生物脅迫條件而變化，包括高溫、低溫、干旱、高鹽堿、滲透脅迫、紫外線輻射、土壤養分缺乏、激光照射、金屬脅迫、缺氧與再氧合、農藥和氣候變化等。包括擬南芥、棉花、水稻、玉米等在內的植物DNA甲基化在逆境脅迫響應中的變化已進行了廣泛的研究，小編選取3篇不同植物在不同非生物脅迫條件下的DNA甲基化變化研究文獻，分別為擬南芥在干旱脅迫、棉花在高溫脅迫、水稻在干旱和鹽脅迫中的抗逆機制研究，并對植物DNA甲基化抗逆機制研究套路進行總結，一起來看看吧。
01擬南芥 抗干旱
標題：Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects（營養期輕度干旱誘導的擬南芥表型、基因表達和DNA甲基化可塑性響應）
期刊：J Exp Bot.
2021影響因子: 6.992
發表時間：2020.06.22
技術平臺：表型鑒定、WGBS、RNA-seq
摘要：
在植物中，通過DNA甲基化的表觀遺傳機制，可以在沒有DNA序列突變的情況下發生可遺傳性狀變異。然而目前尚不清楚這種替代性遺傳機制能否對環境變化做出反應，能否為植物提供快速產生適應性遺傳表型變異的方法。為了評估環境誘導的潛在跨代效應，作者在一個多代實驗中對擬南芥的四種自然品種和對照品種Col-0進行輕度干旱處理。與預期一致，在每個品種中都觀察到對干旱的可塑性響應和親本環境的許多代際影響。然而除了極少數基于性狀的親本效應外，無論是自然環境還是干旱環境下生長，脅迫和非脅迫植物的后代在表型上難以區分。此外，Col-0全基因組DNA甲基化和對應的基因表達分析表明，雖然輕度干旱暴露誘導了植物的DNA甲基化變化，但這些變異沒有被遺傳。本研究表明，輕度干旱脅迫不會誘導跨代表觀遺傳效應。
材料方法：
作者選取4種自然品種Shahdara（Sha；236AV）、Bur-0（172AV）、Tsu-0（91AV）和Cvi-0（166AV）和對照品種Col-0（186AV），在充足水分控制或輕度干旱脅迫兩種不同條件下，每個品種的近交基因系都生長四代。取葉樣進行高通量表型鑒定，對樣本生長規模和相對增長分析以及基于表型形狀的親本效應分析。
為證實輕度干旱對基因表達的影響，作者從干旱脅迫條件和對照Col-0植物中采樣的葉子進行RNA-seq（每次3個重復，共6組數據），每個樣本獲得1830-2370萬reads（平均20.7M）。
為研究全基因組DNA甲基化模式在輕度干旱中的可塑性響應，對從對照和干旱脅迫處理的12株Col-0植物播種后第29天的成熟葉片提取的混合DNA進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）（各1個樣本，2組數據）。為評估代際效應，作者對在標準試管條件下生長10d齡的5個C1C2和5個S1S2 G2株系幼苗進行WGBS測序分析。
結果：
作者對兩代擬南芥進行了詳細的表型分析，并使用個體相對生長率作為應激反應的綜合指標。使用RNA-seq對干旱脅迫的基因表達進行驗證，并在Col-0的DNA甲基化水平上評估了代際表觀遺傳學的可能性。研究結果表明，輕度干旱誘導了所有樣本的表型可塑性響應，但沒有導致遺傳效應方面的任何明顯變化。此外，DNA甲基化數據表明，輕度干旱只引起DNA甲基化代內變化，這種變化僅限于CHH位點，主要影響TE序列。總之研究結果證實，植物通常不會因環境變化而產生跨代效應。本研究結果為植物首先通過轉錄通路或對后代表型的親本影響，從而對生理應激源作出響應的觀點提供了強有力的支持。
圖：應激誘導的DNA甲基化部分變化表征
02棉花 耐高溫
標題：Disrupted genome methylation in response to high temperaturehas distinct affects on microspore abortion and anther indehiscence（DNA甲基化對于高溫脅迫下花粉活性和花藥開裂具有不同的調控作用）
期刊：The Plant Cell
2021影響因子: 11.277
發表時間：2018.06.04
技術平臺：WGBS、RNA-seq、24nt小RNA、qRT-PCR
摘要：
高溫脅迫誘導雄性不育，導致作物產量下降。DNA甲基化調控植物發育和應激反應相關的一系列過程，但DNA甲基化在高溫條件下雄性不育中的作用仍然未知。作者通過進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）來分析高溫和常溫條件下棉花（Gossypium hirsutum）花藥中的DNA甲基化水平，以研究DNA甲基化在高溫下雄性育性中的調控作用。在高溫中檢測到DNA甲基化整體水平的波動，尤其是CHH甲基化（H=A，C/T），24nt小RNA表達水平的變化與DNA甲基化水平顯著相關。在常溫中，DNA甲基化抑制實驗導致高溫中的花粉不育，但不影響花藥的正常開裂。進一步的轉錄組分析表明，高溫中花藥的糖類、活性氧（ROS）代謝通路的基因表達受到顯著調控，但生長素的生物合成和信號傳導通路僅略有變化，表明高溫通過破壞DNA甲基化干擾糖類和ROS代謝，導致雄性敗育。這項研究開辟了使用表觀遺傳學技術培育耐高溫品種的途徑。
材料方法：
課題組前期鑒定了兩個在高溫下存在表型差異的棉花（Gossypium hirsutum）品種：“84021”（耐高溫）和“H05”（敏高溫）。將其在溫室中以14小時日光/10小時夜光進行周期培養。常溫條件：白天29–35°C，夜間25–28°C。高溫條件：39-41℃，夜間29-31℃。在常溫條件下，將DNA甲基化抑制劑Zeb溶液（Zeb溶于蒸餾水，濃度150μM ）噴灑到所有芽上以抑制DNA甲基化。五天后，一半植物作高溫處理，另一半維持在常溫下。同時在相同條件下培養用蒸餾水處理的植物用作對照，將不同批次樣品在高溫或Zeb溶液處理下作為不同的生物學重復單獨儲存。
對芽取樣并按芽長構建為四分體期（6-7mm）、絨氈層降解期（9-14mm）和花藥開裂期（>24mm）。對同一品種相同時期的花藥匯集在試管中，并儲存在-70°C液氮中或立即使用。提取DNA進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和對應的轉錄組分析（24nt小RNA，RNA-seq），并進行qRT-PCR驗證。
結果：
作者采用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）對“84021”和“H05”分別在常溫和高溫條件下構建四分體時期、絨氈層降解時期和花藥開裂期三個重要花藥發育時期的DNA甲基化差異圖譜。結果闡明在高溫脅迫下，“H05”呈現出相對較低的DNA甲基化水平，而“84021”則一直維持在較高的DNA甲基化水平。“H05”中較低的24nt小RNA數量暗示著小RNA介導的DNA甲基化通路（RdDM）受到影響。通過外施DNA甲基化抑制劑，發現“H05”在常溫下出現了類似高溫脅迫下花粉不育的表型，但與此同時花藥壁卻正常開裂。進一步的RNA-seq結果顯示，糖和活性氧代謝通路明顯受到DNA甲基化調控，而生長素通路在抑制劑的處理下卻沒有出現明顯的變化。本研究首次繪制了高溫與常溫下棉花花藥中的DNA甲基化圖譜，并首次發現高溫脅迫下導致的花粉不育和花藥壁不開裂表型受不同通路調控，這對進一步研究高溫導致雄性不育的機理，培育耐高溫品種具有重要意義。
圖：高溫脅迫下花藥發育過程中雄性生育表型和DNA甲基化模式
03水稻 耐高溫+耐高鹽
標題：Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars（WGBS測序揭示水稻在干旱和鹽脅迫下的DNA甲基化變化）
期刊：Genomics
2021影響因子: 5.736
發表時間：2020.09
技術平臺：WGBS、RNA-seq
摘要：
先前研究已鑒定正常生長條件下不同水稻品種之間的DNA甲基化模式和甲基化差異，包括脅迫敏感（IR64），耐旱（Nagina 22）和耐鹽（Pokkali），不同品種之間的甲基化差異主要出現在CG位點。為進一步了解DNA甲基化在干旱和鹽度脅迫下的作用，作者通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析了三組水稻品種（IR64，Nagina 22，Pokkali）在干旱和鹽脅迫條件下DNA甲基化的作用。基因組CG位點中的甲基化和遠端啟動子區域CHH位點中的甲基化與基因表達正相關。Nagina 22中的低甲基化、Pokkali響應干旱和鹽度脅迫的高甲基化分別與少數非生物脅迫應急響應相關的基因高表達相關。大多數差異甲基化區域和差異表達基因（DMR-DEGs）具有品種特異性，表明DNA甲基化在水稻非生物脅迫響應中以品種特異性的方式起重要作用。此外，作者鑒定了因啟動子區域和/或編碼區域中敏感和耐受品種DNA多態性而具有差異甲基化胞嘧啶的DMR-DEGs，表明表位基因在非生物脅迫響應中的作用。
材料方法：
作者分析了三種對非生物脅迫具有對比反應的水稻品種，包括耐干旱的Nagina 22，耐鹽的Pokkali和對兩種脅迫條件敏感的IR64。將兩周齡水培生長的水稻幼苗IR64和Nagina 22用用紙巾折疊包裹3小時作干旱處理。將幼苗放在濃度為200mM的NaCl溶液中3小時來作鹽脅迫處理，脅迫處理的幼苗與對照組幼苗一起在水中保持相同的持續時間。收獲脅迫處理的幼苗，在液氮中快速冷凍并儲存在−80°C。提取基因組DNA并進行全基因組重亞硫酸鹽測序分析和相對應的轉錄組分析。
結果：
本研究對IR64、Nagina 22 和 Pokkali三種水稻品種在脅迫處理后的 DNA 甲基化變化進行測序分析，并與對照條件進行比較。采用WGBS聯合相對應的RNA-seq測序分析鑒定了三組水稻幼苗暴露于干旱脅迫和鹽脅迫的全基因組DNA甲基化變化、蛋白質編碼基因和TEs中的DNA甲基化、DNA甲基化對基因表達的影響、水稻幼苗在非生物脅迫下的差異甲基化區域、干旱脅迫和鹽脅迫條件下差異甲基化與差異基因表達的相關性，并驗證了差異甲基化與DNA多態性在非生物脅迫反應中的作用。總體而言，本研究證明了DNA甲基化在水稻非生物脅迫反應中的特異性作用。
圖：干旱脅迫條件下差異甲基化與差異基因表達的關聯分析
圖：鹽脅迫條件下差異甲基化與差異基因表達的關聯分析
小結：植物DNA甲基化抗逆機制研究套路
植物DNA甲基化在非生物脅迫條件下的變化研究一般遵循三個步驟進行數據挖掘。首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析（WGBS、Plant-RRBS等方式），包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。最后，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。
參考文獻：
Van Dooren TJM, Silveira AB, Gilbault E, et al. Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects. J Exp Bot. 2020;71(12):3588-3602. doi:10.1093/jxb/eraa132
Ma Y, Min L, Wang M, Wang C, Zhao Y, Li Y, Fang Q, Wu Y, Xie S, Ding Y, Su X, Hu Q, Zhang Q, Li X, Zhang X. Disrupted Genome Methylation in Response to High Temperature Has Distinct Affects on Microspore Abortion and Anther Indehiscence. Plant Cell. 2018 Jul;30(7):1387-1403. pii: tpc.18.00074. doi: 10.1105/tpc.18.00074.
Rajkumar MS, Shankar R, Garg R, Jain M. Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars. Genomics. 2020 Sep;112(5):3537-3548. pii: S0888-7543(19)30983-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.04.005. PubMed PMID: 32278023.
DNA甲基化在對環境刺激的反應中起著至關重要的作用。植物DNA甲基化會隨著各種非生物脅迫條件而變化，包括高溫、低溫、干旱、高鹽堿、滲透脅迫、紫外線輻射、土壤養分缺乏、激光照射、金屬脅迫、缺氧與再氧合、農藥和氣候變化等。包括擬南芥、棉花、水稻、玉米等在內的植物DNA甲基化在逆境脅迫響應中的變化已進行了廣泛的研究，小編選取3篇不同植物在不同非生物脅迫條件下的DNA甲基化變化研究文獻，分別為擬南芥在干旱脅迫、棉花在高溫脅迫、水稻在干旱和鹽脅迫中的抗逆機制研究，并對植物DNA甲基化抗逆機制研究套路進行總結，一起來看看吧。
01擬南芥 抗干旱
標題：Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects（營養期輕度干旱誘導的擬南芥表型、基因表達和DNA甲基化可塑性響應）
期刊：J Exp Bot.
2021影響因子: 6.992
發表時間：2020.06.22
技術平臺：表型鑒定、WGBS、RNA-seq
摘要：
在植物中，通過DNA甲基化的表觀遺傳機制，可以在沒有DNA序列突變的情況下發生可遺傳性狀變異。然而目前尚不清楚這種替代性遺傳機制能否對環境變化做出反應，能否為植物提供快速產生適應性遺傳表型變異的方法。為了評估環境誘導的潛在跨代效應，作者在一個多代實驗中對擬南芥的四種自然品種和對照品種Col-0進行輕度干旱處理。與預期一致，在每個品種中都觀察到對干旱的可塑性響應和親本環境的許多代際影響。然而除了極少數基于性狀的親本效應外，無論是自然環境還是干旱環境下生長，脅迫和非脅迫植物的后代在表型上難以區分。此外，Col-0全基因組DNA甲基化和對應的基因表達分析表明，雖然輕度干旱暴露誘導了植物的DNA甲基化變化，但這些變異沒有被遺傳。本研究表明，輕度干旱脅迫不會誘導跨代表觀遺傳效應。
材料方法：
作者選取4種自然品種Shahdara（Sha；236AV）、Bur-0（172AV）、Tsu-0（91AV）和Cvi-0（166AV）和對照品種Col-0（186AV），在充足水分控制或輕度干旱脅迫兩種不同條件下，每個品種的近交基因系都生長四代。取葉樣進行高通量表型鑒定，對樣本生長規模和相對增長分析以及基于表型形狀的親本效應分析。
圖：多代實驗設計示意圖（G植物生長每代；P表型試驗）
為證實輕度干旱對基因表達的影響，作者從干旱脅迫條件和對照Col-0植物中采樣的葉子進行RNA-seq（每次3個重復，共6組數據），每個樣本獲得1830-2370萬reads（平均20.7M）。
為研究全基因組DNA甲基化模式在輕度干旱中的可塑性響應，對從對照和干旱脅迫處理的12株Col-0植物播種后第29天的成熟葉片提取的混合DNA進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）（各1個樣本，2組數據）。為評估代際效應，作者對在標準試管條件下生長10d齡的5個C1C2和5個S1S2 G2株系幼苗進行WGBS測序分析。
結果：
作者對兩代擬南芥進行了詳細的表型分析，并使用個體相對生長率作為應激反應的綜合指標。使用RNA-seq對干旱脅迫的基因表達進行驗證，并在Col-0的DNA甲基化水平上評估了代際表觀遺傳學的可能性。研究結果表明，輕度干旱誘導了所有樣本的表型可塑性響應，但沒有導致遺傳效應方面的任何明顯變化。此外，DNA甲基化數據表明，輕度干旱只引起DNA甲基化代內變化，這種變化僅限于CHH位點，主要影響TE序列。總之研究結果證實，植物通常不會因環境變化而產生跨代效應。本研究結果為植物首先通過轉錄通路或對后代表型的親本影響，從而對生理應激源作出響應的觀點提供了強有力的支持。
圖：應激誘導的DNA甲基化部分變化表征02棉花 耐高溫
標題：Disrupted genome methylation in response to high temperaturehas distinct affects on microspore abortion and anther indehiscence（DNA甲基化對于高溫脅迫下花粉活性和花藥開裂具有不同的調控作用）
期刊：The Plant Cell
2021影響因子: 11.277
發表時間：2018.06.04
技術平臺：WGBS、RNA-seq、24nt小RNA、qRT-PCR
摘要：
高溫脅迫誘導雄性不育，導致作物產量下降。DNA甲基化調控植物發育和應激反應相關的一系列過程，但DNA甲基化在高溫條件下雄性不育中的作用仍然未知。作者通過進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）來分析高溫和常溫條件下棉花（Gossypium hirsutum）花藥中的DNA甲基化水平，以研究DNA甲基化在高溫下雄性育性中的調控作用。在高溫中檢測到DNA甲基化整體水平的波動，尤其是CHH甲基化（H=A，C/T），24nt小RNA表達水平的變化與DNA甲基化水平顯著相關。在常溫中，DNA甲基化抑制實驗導致高溫中的花粉不育，但不影響花藥的正常開裂。進一步的轉錄組分析表明，高溫中花藥的糖類、活性氧（ROS）代謝通路的基因表達受到顯著調控，但生長素的生物合成和信號傳導通路僅略有變化，表明高溫通過破壞DNA甲基化干擾糖類和ROS代謝，導致雄性敗育。這項研究開辟了使用表觀遺傳學技術培育耐高溫品種的途徑。
材料方法：
課題組前期鑒定了兩個在高溫下存在表型差異的棉花（Gossypium hirsutum）品種：“84021”（耐高溫）和“H05”（敏高溫）。將其在溫室中以14小時日光/10小時夜光進行周期培養。常溫條件：白天29–35°C，夜間25–28°C。高溫條件：39-41℃，夜間29-31℃。在常溫條件下，將DNA甲基化抑制劑Zeb溶液（Zeb溶于蒸餾水，濃度150μM ）噴灑到所有芽上以抑制DNA甲基化。五天后，一半植物作高溫處理，另一半維持在常溫下。同時在相同條件下培養用蒸餾水處理的植物用作對照，將不同批次樣品在高溫或Zeb溶液處理下作為不同的生物學重復單獨儲存。
對芽取樣并按芽長構建為四分體期（6-7mm）、絨氈層降解期（9-14mm）和花藥開裂期（>24mm）。對同一品種相同時期的花藥匯集在試管中，并儲存在-70°C液氮中或立即使用。提取DNA進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和對應的轉錄組分析（24nt小RNA，RNA-seq），并進行qRT-PCR驗證。
結果：
作者采用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）對“84021”和“H05”分別在常溫和高溫條件下構建四分體時期、絨氈層降解時期和花藥開裂期三個重要花藥發育時期的DNA甲基化差異圖譜。結果闡明在高溫脅迫下，“H05”呈現出相對較低的DNA甲基化水平，而“84021”則一直維持在較高的DNA甲基化水平。“H05”中較低的24nt小RNA數量暗示著小RNA介導的DNA甲基化通路（RdDM）受到影響。通過外施DNA甲基化抑制劑，發現“H05”在常溫下出現了類似高溫脅迫下花粉不育的表型，但與此同時花藥壁卻正常開裂。進一步的RNA-seq結果顯示，糖和活性氧代謝通路明顯受到DNA甲基化調控，而生長素通路在抑制劑的處理下卻沒有出現明顯的變化。本研究首次繪制了高溫與常溫下棉花花藥中的DNA甲基化圖譜，并首次發現高溫脅迫下導致的花粉不育和花藥壁不開裂表型受不同通路調控，這對進一步研究高溫導致雄性不育的機理，培育耐高溫品種具有重要意義。
圖：高溫脅迫下花藥發育過程中雄性生育表型和DNA甲基化模式03水稻 耐高溫+耐高鹽
標題：Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars（WGBS測序揭示水稻在干旱和鹽脅迫下的DNA甲基化變化）
期刊：Genomics
2021影響因子: 5.736
發表時間：2020.09
技術平臺：WGBS、RNA-seq
摘要：
先前研究已鑒定正常生長條件下不同水稻品種之間的DNA甲基化模式和甲基化差異，包括脅迫敏感（IR64），耐旱（Nagina 22）和耐鹽（Pokkali），不同品種之間的甲基化差異主要出現在CG位點。為進一步了解DNA甲基化在干旱和鹽度脅迫下的作用，作者通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析了三組水稻品種（IR64，Nagina 22，Pokkali）在干旱和鹽脅迫條件下DNA甲基化的作用。基因組CG位點中的甲基化和遠端啟動子區域CHH位點中的甲基化與基因表達正相關。Nagina 22中的低甲基化、Pokkali響應干旱和鹽度脅迫的高甲基化分別與少數非生物脅迫應急響應相關的基因高表達相關。大多數差異甲基化區域和差異表達基因（DMR-DEGs）具有品種特異性，表明DNA甲基化在水稻非生物脅迫響應中以品種特異性的方式起重要作用。此外，作者鑒定了因啟動子區域和/或編碼區域中敏感和耐受品種DNA多態性而具有差異甲基化胞嘧啶的DMR-DEGs，表明表位基因在非生物脅迫響應中的作用。
材料方法：
作者分析了三種對非生物脅迫具有對比反應的水稻品種，包括耐干旱的Nagina 22，耐鹽的Pokkali和對兩種脅迫條件敏感的IR64。將兩周齡水培生長的水稻幼苗IR64和Nagina 22用用紙巾折疊包裹3小時作干旱處理。將幼苗放在濃度為200mM的NaCl溶液中3小時來作鹽脅迫處理，脅迫處理的幼苗與對照組幼苗一起在水中保持相同的持續時間。收獲脅迫處理的幼苗，在液氮中快速冷凍并儲存在−80°C。提取基因組DNA并進行全基因組重亞硫酸鹽測序分析和相對應的轉錄組分析。
結果：
本研究對IR64、Nagina 22 和 Pokkali三種水稻品種在脅迫處理后的 DNA 甲基化變化進行測序分析，并與對照條件進行比較。采用WGBS聯合相對應的RNA-seq測序分析鑒定了三組水稻幼苗暴露于干旱脅迫和鹽脅迫的全基因組DNA甲基化變化、蛋白質編碼基因和TEs中的DNA甲基化、DNA甲基化對基因表達的影響、水稻幼苗在非生物脅迫下的差異甲基化區域、干旱脅迫和鹽脅迫條件下差異甲基化與差異基因表達的相關性，并驗證了差異甲基化與DNA多態性在非生物脅迫反應中的作用。總體而言，本研究證明了DNA甲基化在水稻非生物脅迫反應中的特異性作用。
圖：干旱脅迫條件下差異甲基化與差異基因表達的關聯分析小結：植物DNA甲基化抗逆機制研究套路
植物DNA甲基化在非生物脅迫條件下的變化研究一般遵循三個步驟進行數據挖掘。首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析（WGBS、Plant-RRBS等方式），包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。最后，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。
參考文獻：Van Dooren TJM, Silveira AB, Gilbault E, et al. Mild drought in the vegetative stage induces phenotypic, gene expression, and DNA methylation plasticity in Arabidopsis but no transgenerational effects. J Exp Bot. 2020;71(12):3588-3602. doi:10.1093/jxb/eraa132
Ma Y, Min L, Wang M, Wang C, Zhao Y, Li Y, Fang Q, Wu Y, Xie S, Ding Y, Su X, Hu Q, Zhang Q, Li X, Zhang X. Disrupted Genome Methylation in Response to High Temperature Has Distinct Affects on Microspore Abortion and Anther Indehiscence. Plant Cell. 2018 Jul;30(7):1387-1403. pii: tpc.18.00074. doi: 10.1105/tpc.18.00074.
Rajkumar MS, Shankar R, Garg R, Jain M. Bisulphite sequencing reveals dynamic DNA methylation under desiccation and salinity stresses in rice cultivars. Genomics. 2020 Sep;112(5):3537-3548. pii: S0888-7543(19)30983-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.04.005. PubMed PMID: 32278023.
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