單細胞RNA/蛋白組測序鑒定小鼠胰島細胞亞群對高脂飲食代謝適應性調控
期刊：Diabetologia（IF=10.460）
技術服務：單細胞RNA測序、單細胞蛋白組測序（由上海伯豪生物提供技術服務）
導語
胰島是一種包含多類細胞的精密微小器官，其中α、β和δ等內分泌細胞參與機體血糖穩態的調控。大量研究表明，肥胖誘導的2型糖尿病早期即出現胰島素抵抗伴隨胰島功能障礙，胰島α、β、δ細胞激素分泌開始紊亂，隨著胰島功能損傷的加劇，患者病情也逐漸惡化。嚙齒類動物或人胰島都存在復雜的空間結構，即使相同類型細胞間也存在異質性，而疾病條件下同種類型細胞亞群如何發生變化并影響胰島功能的機制并不明確。因此，掌握2型糖尿病早期胰島α、β、δ細胞亞群的組成變化，并探索可用于區分各亞群的表面標志物，對2型糖尿病的精準治療和預防具有十分重要的現實意義。
實驗方法
采用單細胞RNA測序(scRNA-seq)方法鑒定hfd誘導的小鼠葡萄糖耐受不良模型中的α、β和δ細胞亞群標記物。采用流式細胞儀和免疫染色對各亞群的比例進行分類和評估。對分選細胞進行單細胞蛋白質組學分析，通過蛋白表達深入闡明各α、β、δ細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態。
研究結果
1. 小鼠胰島單細胞RNA測序
本研究對5只普通飲食（cd）喂養的小鼠和5只高脂飲食（hfd）喂養的小鼠進行了高通量scRNA-seq分析。研究分析了15093個來自cd喂養小鼠胰島的細胞和18906個來自hfd喂養小鼠胰島的細胞，發現其被聚成四種主要內分泌細胞，基于主要激素基因表達進行了注釋:4069個α (Gcg)， 14108個β (Ins1)， 1698個δ (Sst)和666個PP (Ppy)細胞。此外，根據先前報道的標記基因，發現了少量內皮細胞、免疫細胞、間充質細胞和導管細胞（圖1-d）。接下來對α，β，δ這幾種細胞類型進行差異基因和功能富集分析，發現內質網的蛋白質加工在α、β和δ細胞中顯著富集（圖1e-g）。
圖1
2. Ace2在α細胞中的異質表達
為了分析α細胞的異質性，使用scRNA-seq數據將α細胞聚成8個簇（圖2a-b），并分析了8個聚類中的marker基因表達（圖2c）。本研究發現與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染相關的關鍵基因Ace2在α細胞群中顯著變化。根據Ace2的表達水平，將8個α細胞簇分為Ace2low(簇3和5)和Ace2high(簇0、1、2、4、6和7)亞群。ScRNA-seq和免疫熒光證實了在cd和hfd小鼠胰島中α細胞亞群的存在（圖f,g,j）。為了探索ace2 α細胞異質性的分子特征，我們在Ace2low和Ace2high亞群之間鑒定出379個差異基因（圖2h），并對差異基因進行了KEGG富集分析（圖2i），表明Ace2的表達可以區分具有不同功能和生存狀態的α細胞。我們還發現，在Ace2low組中，α細胞特異性轉錄因子（Mafb和Irx1）和α細胞相關基因（Ttr、Chgb、Fev和Pyy）顯著下調。相反，Ace2low α細胞開始表達具有β細胞特征的基因（如Ucn3、Ero1lb、和Slc2a2）。其中一些結果通過qPCR（圖2m-q）和western印跡（圖2k）對分選的α細胞群進行了證實。這表明，Ace2low亞群可能代表了未成熟的α細胞，似乎具有β細胞樣特征。
圖2
3. 表明α細胞亞群功能的單細胞蛋白質組學
用胰島單細胞懸液的 FACS將α細胞（胰高血糖素[GCG]+）細胞分為ACE2high組和ACE2low組。值得注意的是，HFD小鼠中ACE2high α細胞的比例（65.3%）明顯低于CD小鼠（80.0%）,這表明基于ace2的α細胞異質性可能參與了糖尿病的病理生理過程（圖3a,b）。從FACS分選的的CD和HFD小鼠（每個樣本2000個細胞）中收集ACE2low和ACE2high α細胞亞群進行單細胞蛋白質組學分析。檢測到的蛋白數量在3042~4021之間，重復性良好。PCA也能明顯區分ACE2low細胞和ACE2high細胞（圖3c）。在CD小鼠中，與ACE2high α細胞相比，ACE2low α細胞中有29個上調，80個DEPs下調(圖3d)，受影響的KEGG通路包括Ras信號通路和有絲分裂活化蛋白激酶（MAPK）信號通路（圖3 e）。在HFD小鼠中，與ACE2high α細胞相比，ACE2low α細胞中的DEPs明顯增加，其中17個上調，301個DEPs下調（圖3 f）。KEGG分析發現與營養和能量代謝相關的途徑在ACE2低組均顯著下調（圖3g）。這些發現強烈暗示了ACE2low α細胞的代謝和其他生物活性減弱，特別是在HFD小鼠中。
圖3
4. CD81在β細胞中的異質表達
為了分析β細胞的異質性，我們將這些細胞聚為9個簇，并確定了前10個標記基因（圖4a-c）。根據最近的一項研究，發現Cd81在細胞簇中有差異表達。研究將9個β細胞簇分為Cd81low（簇0-4和7）和Cd81high（簇5、6和8）亞群（4d-g），發現CD81在CD和HFD小鼠的β細胞中分布的明顯異質性，同時也經過了免疫組化的證實（圖4j）。接下來分析了Cd81low相對于Cd81 highβ細胞的差異基因和KEGG通路分析，細胞代謝及其相關功能通路以及一系列應激相關和炎癥通路被顯著富集。而未成熟的細胞標記物（Chga、Chgb、Mafb和Rbp4）在Cd81high亞群中高表達（圖4l）。這表明Cd81high亞群可能代表了一組功能較弱和未成熟的細胞。其中一些結果通過qPCR（圖4m-p）和westernblot（圖4k）對分選的細胞亞群進行證實。
圖4
5. β細胞亞群功能的單細胞蛋白質組學鑒定
為了進一步探索HFD對β細胞亞群的影響，FACS顯示與CD小鼠相比，HFD小鼠的CD81high細胞比例降低。然后，使用單細胞蛋白質組學（每個樣本10000個細胞）分析FACS分選的CD81low和CD81highβ細胞（圖5a,b）。PCA顯示CD81low和CD81highβ細胞被聚集成兩個獨立的組（圖5c）。比較CD81low和CD81highβ細胞，在CD小鼠中檢測到869個上調和373個下調的DEPs，在HFD小鼠中檢測到707個上調和312個下調的DEPs（圖5d,e）。在CD和HFD小鼠中，與能量代謝相關的途徑（包括氧化磷酸化和阿爾茨海默病）在CD81低亞群中被下調（圖5f,g），并通過免疫組化和western blot進行了驗證。
圖5
6. HFD增強了成熟的Slc2a2 low δ細胞的功能
本研究將δ細胞分為 Slc2a2low and Slc2a2high 亞群，通過Slc2a2low 相比于 Slc2a2high差異基因和KEGG功能富集分析顯示，上調的通路與鈣離子和激素分泌有關，提示Slc2a2low亞組可能功能更成熟（S6a,b）。然而，8周的HFD并沒有改變兩個delta細胞亞群的比例（圖6a,c）。免疫熒光證實了在小鼠和人類胰島中均存在δ細胞亞群（圖6b）。接下來采用FASC對CD和HFD小鼠的Slc2a2low and Slc2a2high δ細胞亞群（每個樣本3000個細胞）進行單細胞蛋白質組學分析。PCA數據顯示，Slc2a2low 和Slc2a2high δ細胞聚集成兩個不同的群體（圖6d）。Slc2a2low 和 Slc2a2high δ細胞亞群之間有548個上調和171個下調的DEPs；同時，HFD小鼠中DEPs上調較多（832），下調較少（102）（圖6e,f)。KEGG分析顯示，與β細胞相似，CD小鼠的Slc2a2low （相對于Slc2a2high δ細胞）中的氧化磷酸化和阿爾茨海默病通路顯著下調(圖6g)。在CD和HFD小鼠的Slc2a2low細胞中，多種營養代謝途徑也顯著上調。綜上所述，Slc2a2low δ細胞可能比Slc2a2high δ更具有功能和代謝活性，而HFD進一步刺激Slc2a2low δ細胞的功能和代謝。
圖6
總之，我們發現未成熟的胰島細胞部分失去了它們的身份維持基因，并開始表現出其他內分泌細胞的特征。在HFD誘導的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2low細胞的比例隨著功能活性和成熟的CD81low細胞比例的增加而增加。成熟的Slc2a2low δ細胞功能增強，但比例不變。這些動態變化揭示了胰島對HFD應激反應的代謝可塑性。這種可塑性適應可以通過抑制高血糖來抵消代謝應激，恢復葡萄糖穩態，增強細胞的低血糖作用，并增加δ對α和β細胞的調節。
圖7
參考文獻：
Fu Q, Jiang H, Qian Y, et al. Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice[J]. Diabetologia, 2022: 1-17.
