InnoScan 生物芯片掃描儀在反向蛋白質微陣列上的應用
概述
本文描述的反相蛋白質微陣列 (RPPA) 平臺位于巴黎（法國）居里研究所內。 該RPPA 平臺的總體目標是通過信號通路分析提供關于蛋白表達水平及其活性的生物學新見解，最終目標是改善癌癥患者的治療和療效。該平臺使用高通量自動化設備（包括 InnoScan 710-IR 掃描儀）對各種類型的微量樣品進行個性化蛋白質組學分析。 將介紹 RPPA 技術的基礎知識，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成為該平臺工作流程的重要組成部分。最后將描述居里研究所進行的癌癥研究應用案例，以說明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微陣列 (RPPA) 是一種高通量小型化斑點印跡和基于抗體的技術（圖 1A），可以分析蛋白表達水平和信號通路的激活狀態（通過研究磷酸化或總蛋白表達）。它結合了高通量分析和消耗微量樣品的優點。事實上，由于 RPPA 技術是一種多指標檢測技術，因此可以在同一張覆有硝酸纖維素的載玻片芯片（微陣列）上同時分析多達一千個樣本。RPPA 工作流程在圖 1，B 中進行了描述。使用專用芯片點樣儀，每個樣品和每個點僅打印 1 至 2 ng 的細胞或組織裂解液。點樣的樣本可以是腫瘤樣本、異種移植物、細胞系或這些樣本的組合，并以連續稀釋和復制的方式系統性地點樣，使該技術具有高穩定性和數據可定量。然后，使用自動染色機，將微陣列按序與抗體和熒光染料孵育以檢測感興趣的蛋白（圖 1A）：
在居里研究所，RPPA 平臺測試了 2000 多種商業抗體，并驗證了 640 種用于 RPPA 標記的一抗，其中近 150 種抗磷酸化蛋白。這組抗體涵蓋了大多數細胞信號通路。對于每個項目，研究員從經過驗證的抗體中選擇感興趣的抗體。 RPPA 平臺不斷評估新抗體，并驗證特定抗體以滿足合作者的要求。陽性和陰性對照使用標有總蛋白染色 FCF（來自 Grace Biolabs 的方案）標記的微陣列作為陽性對照，未標記一抗的微陣列作為陰性對照。在量化和數據分析之前（圖 1C），用InnoScan 710-IR檢測每個樣品點的紅外熒光。掃描儀有兩個激發激光：785nm 和 670nm。得益于實時自動對焦和自動進樣器，可以連續自動掃描 24 張芯片。10µm/像素掃描精度，在 4 分鐘時間內完成一張載玻片芯片的掃描。載玻片上的硝酸纖維素在紅色光譜中具有自發熒光。研究人員選擇使用近紅外熒光來降低硝酸纖維素的背景熒光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 規格完全符合需提供可靠數據的要求，其靈敏度與比色檢測相似，但線性范圍更寬。
圖 1：反相蛋白質微陣列工作流程說明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑點印跡。在使用熒光標記抗體檢測蛋白質之前，將蛋白質打印到硝酸纖維素膜載玻片上。 B. 從蛋白質提取到通過 InnoScan 710-IR采集圖像的工作流程。 C. 使用 PARYS 軟件對圖像進行數據分析。
癌癥研究的應用：
該RPPA 平臺參與了多種項目，涵蓋臨床試驗評估相關基本問題，對合作者提供的樣本提供個性化的高通量蛋白質組學分析，允許：
宮頸癌 (CC)：RAIDs 聯盟歐洲項目
宮頸癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常見的癌癥。大多數宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續感染引起的。事實上，它們通過病毒蛋白 E6 和 E7 使正常細胞控制失效，導致基因組不穩定、分子改變的積累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 歐盟 (EU) 資助的研究在 2013 年至 2017 年間收集了前瞻性宮頸癌樣本（腫瘤和血液）和臨床數據集，涉及來自七個歐盟國家 18 個中心的 419 名參與患者。到目前為止，已經進行了下一代測序（NGS），能夠解析顯性遺傳改變，并且應用反相蛋白質微陣列（RPPA）研究細胞信號通路。
居里研究所RPPA 平臺處理了 280 個樣本，包括基線和非基線腫瘤和細胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）進行樣品處理（蛋白質提取、定量、連續稀釋、陣列點印、標記、掃描、定量和分析）。
采用 194 種特異性一抗對蛋白質反向微陣列進行檢測。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 掃描了355張載玻片微陣列 ，785 nm波段用于檢測抗體或陰性對照，670nm波段用于檢測陽性對照。
RPPA 蛋白表達數據的無監督聚類揭示了三個患者群，分別為富含 EMT（上皮間充質轉化）、DNA 損傷信號和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，見圖 2。與其他兩個集群組合相比，“EMT”集群中的患者顯示出更短的無進展生存期 (PFS), 見圖 3（p=0.03）。
圖 2：在基線腫瘤中，鑒定了具有不同蛋白質表達譜的三個主要簇。表征每個簇的蛋白質：簇 1富含EMT、ErbB 信號，簇 2富含DNA 損傷信號，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信號。
圖 3：由 RPPA 分析定義的宮頸癌患者亞組無進展生存期（n=136）。 “EMT”簇（紅色）與 DNA 損傷和 MAPK/PI3K 信號（藍色）蛋白表達簇的結果比較表明，腫瘤顯示 EMT 相關蛋白表達的患者無進展生存期較差。
此外，來自簇 1 樣本的特征不僅在于 EMT，還在于 PD-L1（程序性死亡配體 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，對于含有 V 組結構域的 T 細胞激活抑制劑 1）的上調表達。見圖 4。
PD-L1 屬于 B7 蛋白家族。它是一種在抗原呈遞細胞（和一些癌細胞）表面表達的蛋白質，與在T 細胞上的PD1 受體結合，當它與其受體連接時，通過抑制 T 細胞活化來調節免疫系統。
B7-H4 也屬于 B7 蛋白家族，抑制 T 細胞活化、增殖、細胞因子產生和細胞毒性形成，負向調節 T 細胞介導的免疫反應。這就是為什么，在未來EMT 生物標志物有可能鑒定出能受益于免疫檢查點抑制劑 (ICI) 療法的患者。最后，基于 RPPA 技術，在三個簇中觀察到 DNA 修復蛋白的表達和激活差異。這一結果可能會引起臨床對 PARP 抑制劑治療的興趣。
圖 4： RPPA 技術揭示的 PD-L1 和 B7-H4 的相對表達水平。 PD-L1 的高表達水平和 簇1 - EMT 的低表達水平。
肝細胞癌 (HCC) 項目
肝細胞癌 (HCC) 是異質性和侵襲性腫瘤。由于這種腫瘤分子機制的復雜性，目前的治療方案在晚期階段不是很有效，在生存方面的益處有限。
該項旨在發現可能對肝細胞癌有效的新化合物或分子和發現治療反應生物標志物。該平臺研究人員使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 個樣本（包括 360 個人類肝腫瘤和非腫瘤組織以及 40 個肝癌衍生細胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各種信號通路的 126 種蛋白質； 82 種總蛋白和 44 種磷酸化蛋白，總共 215 張載玻片微陣列。在 LCCL 數據中，RPPA 結果的無監督聚類將 LCCL 分為 3 個亞組，這些亞組反映了轉錄組亞群和細胞分化狀態（見圖 5）。 
圖 5：LCCL 蛋白質圖譜的分層聚類以及與轉錄組亞群的關聯（c2 檢驗）。第 1 簇：祖細胞亞類，第 2 組：混合上皮間充質，第 3 組：間充質樣細胞
在簇 1（祖細胞亞類）中，肝特異性基因和胎/祖細胞標記物（ALDH1A1、E-鈣粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、細胞角蛋白 19）表達良好，而它們在簇 3（間充質樣細胞）中下調.
簇 2（混合上皮、間充質）和簇 3 有高表達水平的 TGF-β，沒有典型的 β-連環蛋白和 EMT 蛋白，這表明這些細胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，見圖 6 。
圖 6：RPPA方法LCCL 蛋白質的相對表達水平。 LCCL 轉錄組亞組之間差異表達的 19 種蛋白質的箱線圖（Mann-Whitney 檢驗）。
細胞系和腫瘤的 RPPA 數據結合基因組學和轉錄組學數據表明，肝癌細胞系的蛋白質譜似乎代表了來自患者的最具侵襲性肝細胞癌，是了解肝癌發展和藥物反應的好工具。摘要如圖 7 所示。
圖 7：肝細胞癌分子分型。先前建立的肝細胞癌分子分型及其相應的肝癌衍生細胞系亞組與本研究中發現的主要藥物與生物標志物的關聯總結。從以前研究總結的肝細胞癌分子分型和相關特征。 Ampl，放大； mut，突變。
結論:
反相蛋白質微陣列是一種基于抗體的微型高通量技術，可以從少量生物樣品中檢測數百種蛋白質和磷酸化蛋白質。 RPPA 的靈敏度與 InnoScan 710-IR掃描儀相結合是完美的組合，可以為您的研究項目提供將磷酸化蛋白質組學方法與其他組學方法相結合的機會。這一強大的研究工具可幫助您研究信號通路，了解藥物的作用機制，并為預后或治療目標尋找新的生物標志物。
參考文獻:
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
6) Caruso S. et al., (2019). Analysis of Liver Cancer Cell Lines Identifies Agents With Likely Efficacy Against Hepatocellular Carcinoma and Markers of Response. Gastroenterology.
7) Scholl S. et al., (2019). Clinical and genetic landscape of treatment naive cervical cancer: Alterations in PIK3CA and in epigenetic modulators associated with sub-optimal outcome. EBioMedicine.
本文描述的反相蛋白質微陣列 (RPPA) 平臺位于巴黎（法國）居里研究所內。 該RPPA 平臺的總體目標是通過信號通路分析提供關于蛋白表達水平及其活性的生物學新見解，最終目標是改善癌癥患者的治療和療效。該平臺使用高通量自動化設備（包括 InnoScan 710-IR 掃描儀）對各種類型的微量樣品進行個性化蛋白質組學分析。 將介紹 RPPA 技術的基礎知識，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成為該平臺工作流程的重要組成部分。最后將描述居里研究所進行的癌癥研究應用案例，以說明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微陣列 (RPPA) 是一種高通量小型化斑點印跡和基于抗體的技術（圖 1A），可以分析蛋白表達水平和信號通路的激活狀態（通過研究磷酸化或總蛋白表達）。它結合了高通量分析和消耗微量樣品的優點。事實上，由于 RPPA 技術是一種多指標檢測技術，因此可以在同一張覆有硝酸纖維素的載玻片芯片（微陣列）上同時分析多達一千個樣本。RPPA 工作流程在圖 1，B 中進行了描述。使用專用芯片點樣儀，每個樣品和每個點僅打印 1 至 2 ng 的細胞或組織裂解液。點樣的樣本可以是腫瘤樣本、異種移植物、細胞系或這些樣本的組合，并以連續稀釋和復制的方式系統性地點樣，使該技術具有高穩定性和數據可定量。然后，使用自動染色機，將微陣列按序與抗體和熒光染料孵育以檢測感興趣的蛋白（圖 1A）：
在居里研究所，RPPA 平臺測試了 2000 多種商業抗體，并驗證了 640 種用于 RPPA 標記的一抗，其中近 150 種抗磷酸化蛋白。這組抗體涵蓋了大多數細胞信號通路。對于每個項目，研究員從經過驗證的抗體中選擇感興趣的抗體。 RPPA 平臺不斷評估新抗體，并驗證特定抗體以滿足合作者的要求。陽性和陰性對照使用標有總蛋白染色 FCF（來自 Grace Biolabs 的方案）標記的微陣列作為陽性對照，未標記一抗的微陣列作為陰性對照。在量化和數據分析之前（圖 1C），用InnoScan 710-IR檢測每個樣品點的紅外熒光。掃描儀有兩個激發激光：785nm 和 670nm。得益于實時自動對焦和自動進樣器，可以連續自動掃描 24 張芯片。10µm/像素掃描精度，在 4 分鐘時間內完成一張載玻片芯片的掃描。載玻片上的硝酸纖維素在紅色光譜中具有自發熒光。研究人員選擇使用近紅外熒光來降低硝酸纖維素的背景熒光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 規格完全符合需提供可靠數據的要求，其靈敏度與比色檢測相似，但線性范圍更寬。
圖 1：反相蛋白質微陣列工作流程說明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑點印跡。在使用熒光標記抗體檢測蛋白質之前，將蛋白質打印到硝酸纖維素膜載玻片上。 B. 從蛋白質提取到通過 InnoScan 710-IR采集圖像的工作流程。 C. 使用 PARYS 軟件對圖像進行數據分析。
癌癥研究的應用：
該RPPA 平臺參與了多種項目，涵蓋臨床試驗評估相關基本問題，對合作者提供的樣本提供個性化的高通量蛋白質組學分析，允許：
- 蛋白表達水平分析
- 細胞信號通路激活狀態及動態分析
- 預后或預測性生物標志物的鑒定
- 鑒定潛在治療靶點
- 基于蛋白質譜的樣品分類
- 藥效學研究
宮頸癌 (CC)：RAIDs 聯盟歐洲項目
宮頸癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常見的癌癥。大多數宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續感染引起的。事實上，它們通過病毒蛋白 E6 和 E7 使正常細胞控制失效，導致基因組不穩定、分子改變的積累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 歐盟 (EU) 資助的研究在 2013 年至 2017 年間收集了前瞻性宮頸癌樣本（腫瘤和血液）和臨床數據集，涉及來自七個歐盟國家 18 個中心的 419 名參與患者。到目前為止，已經進行了下一代測序（NGS），能夠解析顯性遺傳改變，并且應用反相蛋白質微陣列（RPPA）研究細胞信號通路。
居里研究所RPPA 平臺處理了 280 個樣本，包括基線和非基線腫瘤和細胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）進行樣品處理（蛋白質提取、定量、連續稀釋、陣列點印、標記、掃描、定量和分析）。
采用 194 種特異性一抗對蛋白質反向微陣列進行檢測。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 掃描了355張載玻片微陣列 ，785 nm波段用于檢測抗體或陰性對照，670nm波段用于檢測陽性對照。
RPPA 蛋白表達數據的無監督聚類揭示了三個患者群，分別為富含 EMT（上皮間充質轉化）、DNA 損傷信號和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，見圖 2。與其他兩個集群組合相比，“EMT”集群中的患者顯示出更短的無進展生存期 (PFS), 見圖 3（p=0.03）。
圖 2：在基線腫瘤中，鑒定了具有不同蛋白質表達譜的三個主要簇。表征每個簇的蛋白質：簇 1富含EMT、ErbB 信號，簇 2富含DNA 損傷信號，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信號。
圖 3：由 RPPA 分析定義的宮頸癌患者亞組無進展生存期（n=136）。 “EMT”簇（紅色）與 DNA 損傷和 MAPK/PI3K 信號（藍色）蛋白表達簇的結果比較表明，腫瘤顯示 EMT 相關蛋白表達的患者無進展生存期較差。
此外，來自簇 1 樣本的特征不僅在于 EMT，還在于 PD-L1（程序性死亡配體 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，對于含有 V 組結構域的 T 細胞激活抑制劑 1）的上調表達。見圖 4。
PD-L1 屬于 B7 蛋白家族。它是一種在抗原呈遞細胞（和一些癌細胞）表面表達的蛋白質，與在T 細胞上的PD1 受體結合，當它與其受體連接時，通過抑制 T 細胞活化來調節免疫系統。
B7-H4 也屬于 B7 蛋白家族，抑制 T 細胞活化、增殖、細胞因子產生和細胞毒性形成，負向調節 T 細胞介導的免疫反應。這就是為什么，在未來EMT 生物標志物有可能鑒定出能受益于免疫檢查點抑制劑 (ICI) 療法的患者。最后，基于 RPPA 技術，在三個簇中觀察到 DNA 修復蛋白的表達和激活差異。這一結果可能會引起臨床對 PARP 抑制劑治療的興趣。
肝細胞癌 (HCC) 項目
肝細胞癌 (HCC) 是異質性和侵襲性腫瘤。由于這種腫瘤分子機制的復雜性，目前的治療方案在晚期階段不是很有效，在生存方面的益處有限。
該項旨在發現可能對肝細胞癌有效的新化合物或分子和發現治療反應生物標志物。該平臺研究人員使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 個樣本（包括 360 個人類肝腫瘤和非腫瘤組織以及 40 個肝癌衍生細胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各種信號通路的 126 種蛋白質； 82 種總蛋白和 44 種磷酸化蛋白，總共 215 張載玻片微陣列。在 LCCL 數據中，RPPA 結果的無監督聚類將 LCCL 分為 3 個亞組，這些亞組反映了轉錄組亞群和細胞分化狀態（見圖 5）。
圖 5：LCCL 蛋白質圖譜的分層聚類以及與轉錄組亞群的關聯（c2 檢驗）。第 1 簇：祖細胞亞類，第 2 組：混合上皮間充質，第 3 組：間充質樣細胞
在簇 1（祖細胞亞類）中，肝特異性基因和胎/祖細胞標記物（ALDH1A1、E-鈣粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、細胞角蛋白 19）表達良好，而它們在簇 3（間充質樣細胞）中下調.
簇 2（混合上皮、間充質）和簇 3 有高表達水平的 TGF-β，沒有典型的 β-連環蛋白和 EMT 蛋白，這表明這些細胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，見圖 6 。
圖 6：RPPA方法LCCL 蛋白質的相對表達水平。 LCCL 轉錄組亞組之間差異表達的 19 種蛋白質的箱線圖（Mann-Whitney 檢驗）。
細胞系和腫瘤的 RPPA 數據結合基因組學和轉錄組學數據表明，肝癌細胞系的蛋白質譜似乎代表了來自患者的最具侵襲性肝細胞癌，是了解肝癌發展和藥物反應的好工具。摘要如圖 7 所示。
圖 7：肝細胞癌分子分型。先前建立的肝細胞癌分子分型及其相應的肝癌衍生細胞系亞組與本研究中發現的主要藥物與生物標志物的關聯總結。從以前研究總結的肝細胞癌分子分型和相關特征。 Ampl，放大； mut，突變。
結論:
反相蛋白質微陣列是一種基于抗體的微型高通量技術，可以從少量生物樣品中檢測數百種蛋白質和磷酸化蛋白質。 RPPA 的靈敏度與 InnoScan 710-IR掃描儀相結合是完美的組合，可以為您的研究項目提供將磷酸化蛋白質組學方法與其他組學方法相結合的機會。這一強大的研究工具可幫助您研究信號通路，了解藥物的作用機制，并為預后或治療目標尋找新的生物標志物。
參考文獻:
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
6) Caruso S. et al., (2019). Analysis of Liver Cancer Cell Lines Identifies Agents With Likely Efficacy Against Hepatocellular Carcinoma and Markers of Response. Gastroenterology.
7) Scholl S. et al., (2019). Clinical and genetic landscape of treatment naive cervical cancer: Alterations in PIK3CA and in epigenetic modulators associated with sub-optimal outcome. EBioMedicine.
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