文章標題：Metabolomic and transcriptomic analyses provide insights into metabolic networks during cashew fruit development and ripening
發表期刊：Food Chemistry
影響因子：9.231作者單位：海南大學
百趣生物提供服務：植物阿趣廣靶®代謝組學、發現代謝組學HD-MIX版

百趣代謝組學分享—研究背景
腰果樹(Anacardium occidentale L.)是一種原產于巴西亞馬遜雨林的熱帶常綠喬木。自腰果樹發現以來，便被引入世界各地的熱帶地區廣泛種植。腰果樹的果實有上、下兩部分，上部分呈現梨果狀，是假果，叫“Apple”；下部分呈現腎狀，是真果，叫“Nut”，也就是備受人們歡迎的堅果之一——腰果（在后文中，統一稱為“Apple”和“Nut”）。

迄今為止，人們對“Nut”的研究主要集中在它的營養價值上。“Nut”富含不飽和脂肪酸，它的脂肪成分中，約60%來自單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid, MUFAs)，20%來自多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)。由于MUFAs和PUFAs可有效調控總膽固醇和低密度脂蛋白水平，因此食用腰果有助于預防心血管疾病。而相比“Nut”的高價值，多汁的“Apple”更像是一種農業副產品，工業用途有限，通常被用于果汁加工、濃縮粉生產以及乙醇生產。

果實發育和成熟是相互協調、精細調控的生物學過程。代謝組學分享，盡管前人對“Nut”以及“Apple”的化學成分進行了研究，但“Nut”以及“Apple”發育成熟過程中的代謝變化和相關調控機制尚不明晰，本研究主要探索腰果發育周期中代謝是如何變化的，并挖掘轉錄調控的潛在機制。

2.百趣代謝組學分享—研究設計
腰果樹的果實發育具有很典型的階段性，開花后大約一周，腰果花就開始發育成微小的假果，即“Apple”；同時，綠色的真果“Nut”，也開始長在“Apple”的底端。代謝組學分享，之后，整個果實迅速生長直至成熟期。基于這樣的特點，作者以時間為軸線，結合了代謝組學和轉錄組學來探索腰果樹果實的代謝變化過程。

作者采集開花后15、23、31、39和45天的果實，分別對“Apple”和“Nut”取樣，進行實驗。對應這5個果實發育階段，樣本命名為A1-A5(Apple)和N1-N5(Nut)，其研究思路詳見圖1。
 

圖1. 技術路線圖以及腰果果實開花后“Nut”和“Apple”部位的外觀變化。

3.百趣代謝組學分享—研究結果
腰果樹果實發育成熟過程中的代謝特征
本研究通過代謝組學檢測發現“Nut”共鑒定出1137個代謝物，而“Apple”共鑒定出567個代謝物。從主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)可以看出，“Nut”和“Apple”的代謝物數據可以明確分為5組，對應各個發育階段，說明“Nut”和“Apple”中代謝物的積累與不同發育階段有著密切的關系，詳見圖2B。
 

圖2. “Nut”和“Apple”五個發育階段的代謝組學分析。(A)代謝物的數量和分類；(B)“Nut”和“Apple”代謝組數據的主成分分析。N1-N5和A1-A5表示在開花后15、23、31、39和45天采集的“Nut”和“Apple”樣本。

腰果樹果實發育階段的脂質分析
“Nut”因含有豐富的脂質種類而聞名。在本研究中，作者利用脂質組學全面測定了“Nut”的脂質情況。研究發現，“Nut”中含量最高的脂質物質為Ethyl dodecanoate。此外，還有161種常見脂質，這些脂質可分為五大類，即脂肪酰基(Fatty Acyls, FAs)、甘油磷脂(Glycerophospholipids, GPs)、甘油脂(Glycerols, GLs)、糖脂(Sophorolipids, SLs)和鞘脂(Sphingolipids, SPs)。從圖3A可以看出，FAs和GPs占總脂類含量的97%以上。

在FAs中，游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)是最主要的成分；在GPs中，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰甲醇(PMeOH)的含量最高；在FAs中，飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acids, SFAs)的含量高于MUFAs和PUFAs。代謝組學分享，從圖3B可看出，在“Nut”發育過程中，MUFAs是GPs中的優勢組分。從圖3C可看出，在“Nut”發育過程中，FFA(16:0)含量相對穩定，FFA(18:1)和FFA(18:2)含量逐漸降低，PI(16:0/18:2)的含量下降，而PI(18:1/18:1)和PMeOH含量明顯上升。
 

圖3. “Nut”五個發育階段的脂體組分析。(A)不同脂質家族和種類的含量；(B)FAs和GPs的分布，Bars表示標準差；(C)FAs和GPs中優勢組分的相對含量。

果實從發育到成熟過程中的轉錄組分析
在轉錄組分析中，作者將TPM(Transcripts Per Million)>0的基因定義為表達基因，將絕對值Log2（TPM的差異倍數）>1的基因定義為差異表達基因。代謝組學分享，經分析，“Nut”中的基因表達量是36911個，其中有24017個基因在至少兩組樣本中為差異表達基因；而“Apple”的基因表達量為37624個，其中有17647個在至少兩組樣本中為差異表達基因。

作者進一步進行Z-Score歸一化表達分析，Z-score值熱圖（圖4A）顯示，“Nut”和“Apple”的基因表達模式與果實發育階段息息相關。PCA（圖4B）結果中，N1和A1比較接近，表明在果實發育早期，“Nut”和“Apple”具有相似的轉錄模式；而到了果實成熟階段，“Nut”和“Apple”有顯著的差異。綜上說明，腰果樹的基因表達模式具有組織和發育階段的特異性。

代謝組和轉錄組在不同階段的簇中共同調控
為了進一步揭示腰果果實發育過程中的代謝變化，通過K-means聚類分析（圖4C和4D）可知，“Nut”的1137個代謝物和“Apple”的567個代謝物分為6個和5個聚類簇。在“Nut”中，簇1的代謝物在整個果實發育過程中逐漸積累，簇2的代謝物在果實成熟后期富集，簇6的代謝物僅在發育早期有較高積累，簇2、簇3以及簇5的代謝物在發育中期積累較多。代謝組學分享，在“Apple”中，簇2的代謝產物在整個果實發育過程中逐漸積累，簇3的代謝產物在成熟后期顯著積累，表明其與果實成熟密切相關。

為了研究基因表達與代謝物累積之間的關系，我們對代謝組和轉錄組數據進行了共表達分析。從圖4C可看出，“Nut”中共鑒定出23,980個與至少一種代謝物共調控的基因，它們和1137個代謝物分成6個共表達簇。圖4D可看出，在“Apple”中，則鑒定出有20591個基因與567個代謝物共調控，它們分成5個基因簇。這兩個組學的共表達分析表明，基因的表達模式與腰果樹果實發育過程中的代謝途徑有關。
 

圖4. 代謝物和基因的轉錄組分析和k-Means聚類分析。(A)“Nut”和“Apple”5個發育階段表達層次聚類分析。顏色尺度0-1表示Spearman相關系數；(B)轉錄組的PCA分析；(C)和(D)k-均值聚類分析代謝物和基因。×軸描述了來自五個發育階段的“Nut”和“Apple”，y軸描述了標準化的每個代謝物(橙色)和基因(藍色)的Z-score。每個方框中顯示的數字來自每個聚類中的代謝物和基因的數量。N1-N5和A1-A5表示花后15、23、31、39和45d采集的“Nut”和“Apple”樣品。

識別調節PI（Phosphatidylinositols, 磷脂酰肌醇）生物合成的潛在基因和轉錄因子
“Nut”中主要的不飽和脂肪酸是GPs，尤其是PIs。作者利用K-Means聚類和KEGG分析，進一步挖掘PI的合成途徑的調控因子。研究發現17個屬于簇1的基因在PI的合成通路中富集，包括9個甘油-3-磷酸�；�轉移酶(GPAT)，5個1-酰基甘油-3-磷酸�；�轉移酶(AGPAT)，2個磷脂酰基轉移酶(CDS)和1個磷脂酰肌醇合成酶(PIS)的編碼基因。

由于“Nut”和“Apple”在果實發育早期階段具有相似的轉錄模式（圖4B），因此作者只對N2-N5組進行基因表達分析。

代謝組學分享，從圖5A可看出，在以上的17個基因中，大部分基因在“Nut”發育過程中逐漸上調，表明它們參與了PI合成。此外，研究者還鑒定簇1的一個基因(anoc .0013 s0182)，這個基因能夠編碼轉錄因子WRKY11，而這個轉錄因子與PI含量密切相關。進一步的分析也表明（圖5B），GPAT和AGPAT的編碼基因與WRKY11具有很強的共表達。作者還檢測了GPAT和AGPAT的編碼基因的啟動子區域，確定了W-box的存在，表明WRKY11可能參調控PI的合成。
 

圖5. “Nut”PI生物合成基因的表達模式及調控轉錄因子的鑒定。(A)“Nut”PI生物合成相關結構基因在5個發育時期的表達，基因的表達水平采用Z-score標準化；(B)通過注釋的WRKY11與結構基因之間的相關性構建網絡，每個基因對的加權Pearson相關系數值用實線(正)和虛線(負)表示。

鑒定調控蔗糖代謝的潛在基因和轉錄因子
蔗糖等可溶性總固體(Total Soluble Solid, TSS)是果實成熟的關鍵指標。代謝組分析結果顯示，成熟的“Apple”中最主要的成分——蔗糖（在簇2代謝物中）在腰果樹果實成熟過程中逐漸積累�；�于此，作者研究了參與蔗糖代謝途徑的潛在的關鍵基因，在簇2的基因中檢測到15個與蔗糖代謝和淀粉水解相關的關鍵基因（包括4個蔗糖雙向轉運蛋白基因(SWEETS)、2個轉移酶基因(INVS)、3個蔗糖合成酶基因(SUSS)、1個果糖激酶基因(Frk)、1個己糖激酶基因(HXK)、1個蔗糖磷酸酶基因(SPP)和3個β-淀粉酶基因(BAM)）。從圖6A可以看出，這15個基因在果實發育過程中均逐漸上調，尤其是在成熟階段高度上調。

此外，作者從基因簇2中鑒定出19個與蔗糖代謝密切相關的轉錄因子（包括4個MYB，2個WRKY，2個乙烯響應因子(ERF)、1個熱激轉錄因子(HSF)和7個與器官發育相關的轉錄因子），這些轉錄因子均與上文參與蔗糖代謝的15個基因高度相關（圖S6）。在這19個轉錄因子中，有三個轉錄因子被注釋為WRKY、ERF和MYB(anoc .0207 s0003、anoc .0002 s0035、anoc .0004 s1381)（圖S5），從圖6B可以看出，它們的表達隨著果實的成熟而顯著升高。代謝組學分享，通過構建并可視化這三個轉錄因子介導的潛在調控網絡（圖6C），進一步證明這三個轉錄因子與蔗糖相關基因之間存在高度的連通性，表明它們可能在蔗糖代謝和果實成熟過程中發揮作用。
 

圖6. “Apple”蔗糖代謝基因的表達模式及調控轉錄因子的鑒定。(A)“Apple”5個發育時期蔗糖代謝相關結構基因的表達模式，基因的表達水平采用Z - score標準化；(B)鑒定轉錄因子的表達模式；(C) 3個鑒定的轉錄因子(MYB、ERF、WRKY)與蔗糖代謝基因的共表達網絡分析，每個基因對的加權Pearson相關系數值用實線（正）和虛線（負）表示。SPP：蔗糖磷酸酶；SWEET：雙向糖轉運蛋白；SUS：蔗糖合成酶；INV：轉化酶；FRK：果糖激酶；HXK，己糖激酶；BAM：β -淀粉酶。

4.百趣代謝組學分享—總結
本研究基于UHPLC-Q-Exactive-MS的非靶實驗，檢測到“Nut”有1137個代謝物，這些代謝物中，脂質可分為5大類，而最主要的脂類是FAs和GPs。代謝組學分享，除了探討了某些特定脂質在發育過程的代謝變化外，作者從PI是GPs的主要成分為切入點，結合轉錄組的數據，通過分析相同變化趨勢的代謝物和基因的聚類簇，發現17個參與PI合成的基因，還確定了能夠潛在調控PI合成的轉錄因子WRKY11。

基于UHPLC-QTRAP-MS/MS(MRM)的廣靶分析，本研究檢測到“Apple”有567個代謝物，TSS是果實成熟的關鍵指標，作者從成熟的“Apple”最主要的成分——蔗糖為切入點，結合轉錄組數據，通過分析相同變化趨勢的代謝物和基因的聚類簇，揭示了與糖合成相關的15個代謝基因和19個轉錄因子。

總體而言，該研究在腰果樹果實的發育研究中，引入了代謝網絡相關的新視角，為進一步研究腰果育種提供了寶貴的資源。
 

圖7. 圖形概要