文獻解讀：人類乳腺正常、癌前和致瘤狀態的單細胞RNA表達圖譜
期刊：EMBO J（IF=14.012）
技術：scRNA-seq
導語
為了檢測乳腺異質性在不同狀態下的整體變化，對34種未經治療的原發腫瘤(包括雌激素受體(ER)+、HER2+和三陰性乳腺癌)的scRNA-seq分析顯示，癌細胞和循環細胞的離散亞群之間具有相當的多樣性。
在腫瘤免疫領域，增生性CD8+ T細胞是三陰性和HER2+癌癥的特征，而不是ER+腫瘤，而所有亞型都包含循環腫瘤相關的巨噬細胞，因此調用了潛在的不同的免疫治療靶點。配對的ER+腫瘤和淋巴結的拷貝數分析表明，由基因不同的克隆播種或原發腫瘤細胞大規模遷移到腋窩淋巴結。這種大規模的患者樣本整合提供了正常和癌變人類乳腺細胞多樣性的高分辨率圖譜。
研究結果
1. 以高分辨率繪制腫瘤和正常乳腺組織的細胞多樣性
對來自55名患者的69個不同的手術組織標本構建了scRNA-seq文庫，獲得了近43萬個單個細胞的表達譜。上皮細胞根據CD49f和CD326表達進行分類。先前的細胞分選揭示了三種明確的上皮細胞簇，分別對應于基底細胞、腔內祖細胞(LP)和成熟腔內細胞(ML)。移除基質亞群，并重新整合11例患者的剩余細胞。絕經前(n = 8)和絕經后(n = 3)女性的比較根據激素狀態顯示相似的聚類分布。重新聚類確認了三個主要的cluster和一個非常小的中間簇。利用細胞分選和RNA-seq技術鑒定基底、LP和ML細胞群的表達特征，然后，根據每個細胞表達的基礎、LP或ML特征基因的比例，將每個細胞定位在三元圖上。然后將tSNE圖中的聚類顏色疊加到三元圖上，識別出基底、LP和ML群體。這些數據與X染色體失活研究以及細胞色素C氧化酶缺陷細胞的克隆跟蹤研究相一致，這兩項研究都表明存在雙性前體細胞。
圖1. 正常乳腺上皮細胞的乳腺圖譜和scRNA-seq分析工作流程
2. 闡明正常乳房微環境和伴隨激素狀態的變化
通過分析從絕經前(n = 8)和絕經后(n = 5)女性減容乳房成形術中分離出來的總組織細胞，研究了正常乳腺組織的免疫和基質微環境。經過質量篩選后，scRNA-seq分析得到54,332個細胞的表達譜。單細胞表達譜的整合和聚類產生了8個主要的cluster。EPCAM表達顯示其中3個cluster為上皮細胞。為了進一步探究導管微環境中細胞的身份，將EPCAM+上皮細胞移除，剩余細胞重新聚集，從而產生7個非上皮細胞的cluster。偽體樣本的差異表達分析為每個cluster選擇了標記基因，確定了細胞類型。與人類乳房的纖維和血管性質一致，成纖維細胞、內皮細胞和周細胞構成了主要部分。絕經前和絕經后組織微環境中的組織常駐細胞表現出一些差異。在絕經后組織中，成纖維細胞和血管內皮細胞的比例分別較低和較高。盡管患者間存在差異，但絕經前和絕經后微環境之間的細胞類型組成差異具有統計學意義。
圖2. 絕經后乳腺組織微環境的轉錄變化
3. 絕經后乳腺組織中上皮相關成纖維細胞的變化
除某些髓系marker外，大多數免疫亞群的幾個決定性細胞標記物在絕經前和絕經后組織之間的表達相似。在成纖維細胞中，基質相關基因的細胞比例較低。乳腺組織的高分辨率共聚焦成像顯示，絕經后組織中PDGFRb+成纖維細胞的表達和空間分布顯著減少。將絕經前和絕經后婦女的細胞重新聚類，在這5個cluster中，有3個cluster在所有激素環境下的標本中都是常見的。KEGG通路分析顯示cluster1富含免疫調節信號通路。頂部標記基因表達分析顯示，cluster 1中基質金屬蛋白酶和趨化因子表達豐富。cluster2的特征是與立即早期反應相關的轉錄因子和DNA損傷基因的表達相關。
圖2. 絕經后乳腺組織微環境的轉錄變化
4. BRCA1突變攜帶者癌前組織分析
對4名BRCA1突變攜帶者的預防性乳房切除術(病理正常)中獲得組織進行scRNA-seq分析，與圖2A中的8個正常(WT)絕經前合并分析，生成了包含59,766個乳腺細胞的聯合t-SNE圖。正常組織和癌前組織中不同簇的比例相似(P = 0.14)。對4例BRCA1突變TNBC腫瘤患者，與先前確定的瘤前病變譜進行整合，聚類發現13個cluster。
圖4. 正常組織、BRCA1+/-癌前組織和BRCA1相關腫瘤的scRNA-seq比較
5. BRCA1+/-癌前組織與腫瘤的微環境改變
去除正常和腫瘤上皮細胞后，微環境中的細胞重新聚類，產生9個cluster。腫瘤與癌前組織的微環境有明顯的實質性變化，兩組患者的cluster分布不均勻。基質細胞和血管細胞所占比例較小，這可能反映了腫瘤浸潤免疫細胞的轉移。個體患者之間的cluster比例有相當大的差異。在BRCA1相關腫瘤中明顯存在大量TIL人群。Treg細胞在腫瘤中顯著，而在癌前組織中檢測不到。在不同患者樣本的基質和免疫組成中觀察到的巨大差異不僅反映了固有的組織多樣性，還反映了其他參數，包括病理標本在整個腫瘤/組織中的位置，組織收集和處理之間的時間，以及用于分離不同細胞類型的精確消化方案。
圖5. BRCA1+/-癌前組織與腫瘤的微環境改變
6. 乳腺癌主要亞型之間的腫瘤異質性
CNV分析用于區分正常和惡性上皮細胞，在HER2+和ER+標本中檢測到正常上皮cluster。每個腫瘤亞型都包含兩個突出的EPCAM+。所有亞型都包含一個離散的循環MKI67+腫瘤細胞簇，但這在TNBC中最為普遍。TNBC中的MKI67+亞群在ESR1和PGR中呈陰性，而在HER2+腫瘤中，兩個cluster都表達ERBB2+和ESR1。ER+腫瘤的KEGG通路分析顯示，cluster1中雌激素和類固醇信號通路富集，cluster2中DNA復制和修復通路富集。
圖6. 乳腺癌主要亞型之間的腫瘤異質性
7. 不同乳腺腫瘤亞型微環境的反卷積
微環境中的主要的cluster是根據譜系特異性基因的表達來確定的。偽體樣本的熱圖顯示了每個cluster的marker基因。通過偽體讀計數的差異表達分析，確定每個cluster的前30個marker基因。
圖7. 不同乳腺腫瘤亞型微環境的反卷積
8. 分析原發腫瘤和浸潤淋巴結的scRNA-seq，可以確定腫瘤細胞的克隆繁殖
結合7例ER+患者匹配的腫瘤和淋巴結樣本的t-SNE圖。顯示了根據原發腫瘤或受累淋巴結細胞(黃色)標記的合并細胞。繪制每條染色體的拷貝數變異(CNV)。通過CNV豐度可以將腫瘤細胞與正常(N)細胞區分開。
圖8. 分析原發腫瘤和浸潤淋巴結的scRNA-seq，可以確定腫瘤細胞的克隆繁殖
參考文獻：
Pal B, Chen Y, Vaillant F, Capaldo BD, Joyce R, Song X, Bryant VL, Penington JS, Di Stefano L, Tubau Ribera N, Wilcox S, Mann GB; kConFab; Papenfuss AT, Lindeman GJ, Smyth GK, Visvader JE. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. EMBO J. 2021 Jun 1;40(11):e107333. doi: 10.15252/embj.2020pub 2021 May 5. PMID: 33950524; PMCID: PMC8167363.
