期刊：nature communications（17.694）
技術服務：scRNA-Seq測序

導語
腫瘤內異質性作為研究腫瘤分子特征不可回避的話題，腫瘤細胞的進化及腫瘤細胞與腫瘤微環境（TME）的持續作用都有可能導致腫瘤異質性的出現。由于腫瘤的進化伴隨著腫瘤細胞和TME的持續相互作用，因此定義細胞特征及其潛在的分子通信網絡(它們塑造了腫瘤生態環境，從而推動了腫瘤的進化)可能是提高對腫瘤生態系統的分子理解和開發有效的實體腫瘤治療方法的關鍵。現有大量研究也表明，腫瘤內異質性與病人預后也存在很大的相關性。

理論假設
本文作者認為，每個腫瘤生態系統都可能代表了腫瘤細胞在特定的選擇壓力下促進腫瘤進化的腫瘤-基質相互作用網絡的獨特組合，因此，腫瘤細胞和基質/免疫細胞間的互作代表著該狀態下腫瘤生物學的特定指紋特征。這一特征類似描述酶-底物相互作用的鎖-鑰匙模型。

實驗思路
本文作者對七個病人組織樣本進行單細胞測序（4例HCC和3例ICCA），研究惡性細胞的動態以及惡性細胞與腫瘤相關免疫細胞間的通訊網絡，使用額外的25例HCC和12例iCCA患者的scRNAseq數據進行驗證，并將一些顯著的受配體對在額外收集的542例HCC病人轉錄組數據中驗證。

設計亮點：目前大量研究主要依賴于對腫瘤組織單個區域取樣獲得的活檢樣本，探索其細胞組成。很可能受到取樣位置的影響。本研究采取對每個病人多區域取樣做單細胞檢測降低由于取樣偏差帶來的影響。結果表明，腫瘤異質性明顯存在，但無論腫瘤細胞組成還是腫瘤細胞和腫瘤微環境的信息交流的變化腫瘤內部的變化小于腫瘤間的變化。

主要結果
本文共收集七個病人的樣本，每個病人分別取五個位置獲取活檢樣本（分別命名為B、N、T1、T2、T3；其中3CT3樣本建庫失敗），共34個樣本進行單細胞測序。
 

以正常肝組織作為對照，采用inferCNV識別腫瘤惡性細胞，將檢測到惡性細胞數目大于10的樣本納入后續惡性細胞分析，共保留來自六個患者（1H、2H、3H、4H、1C、3C）的數據，如下：
 

1. 探究腫瘤區域間異質性
對來源于各患者不同區域腫瘤惡性細胞t-SNE降維聚類結果顯示，惡性細胞傾向于聚成患者特異的cluster，且患者間異質性要高于區域間異質性。層次聚類結果顯示，來源于同一個患者的各區域腫瘤細胞傾向于聚在一起，且與腫瘤大小無顯著關聯。本文進一步比較了來源于同一患者不同腫瘤區域的組織學特征，發現腫瘤區域間具有顯著差異。
 

為了進一步定量評估區域內的異質性，文章計算了同一取樣區域內惡性細胞間的相關性，和不同區域各惡性細胞間的相關性，結果表明同一區域內和來源于同一患者各區域間的相關性遠高于不同患者間相關性。
 

對上皮細胞t-SNE降維聚類結果顯示，惡性細胞表現出樣本特異性的表達模式，而來源于不同樣本正常組織的上皮細胞混在一起，共享相同的表達模式。
 

文章進一步計算了腫瘤核心位置和邊緣位置腫瘤異質性比例和腫瘤大小關系、腫瘤區域間異質性均值和腫瘤大小關系、腫瘤內細胞間相關性和腫瘤大小關系，結果表明，雖然腫瘤大小和組織學特征可能在患者之間有所不同，但患者內部各腫瘤細胞轉錄組活性的差異要比患者之間的差異小得多。
 

為了評估與轉錄組異質性相關的不同區域的惡性細胞的細胞狀態，文章進行RNA速率分析，并分析與細胞增殖相關的四個干性基因的表達情況，結果表明雖然不同干性基因表達出明顯的異質性，但其在惡性細胞的表達在腫瘤的不同區域卻呈現相似的細胞軌跡。
 

文章采用熒光激活分選的方法（FACS）篩選EPCAM+ 細胞和 GPC3+ 細胞，已知這兩種marker在腫瘤細胞中顯著表達。結果顯示EPCAM+或GPC3+細胞在腫瘤核心區域的比例相對穩定，但與腫瘤邊緣區域相比存在差異。免疫組化結果顯示SPP1基因表達在腫瘤細胞中顯著升高。
 

2. 識別多區域間腫瘤-免疫通訊網絡
文章以CellPhoneDB方法識別惡性細胞與TME間的受配體互作對，進一步探索在患者內部多區域高度保守的病人特異互作網絡。結果顯示，基于分子層面的通訊網絡在采樣區域間表現較好的穩定性，在病人間展現高度特異性，且在HCC患者中穩定性好于ICCA組患者。文章采用隨機洗牌的方式評估腫瘤細胞和TME對患者特異性受配體的貢獻率，結果表明每種腫瘤在腫瘤細胞和TME之間可能包含相對穩定但獨特的通信網絡，其中惡性細胞在患者特異性模式中起主導地位。
 

3. 識別與患者臨床特征相關的分子特征
文章將基于單細胞數據得到受配體對在包含生存數據的542HCC三套數據集的常規bulk轉錄組數據中驗證其與生存相關性，得到各樣本受配體對表達圖譜，基于層次聚類結果顯示，樣本被分為具有不同互作模式的兩組，且兩組腫瘤樣本總體生存期存在顯著差異。文章發現GALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4 受配體在三套數據集中高度一致且在組內特征貢獻較大。進一步表明互作網絡是HCC侵襲性的一個穩定特征，類似于鎖-鑰匙特征酶和底物的相互作用的腫瘤-免疫/基質相互作用對的獨特組合可以作為腫瘤侵襲性的分類器。
 

為進一步驗證受配體相互作用與HCC預后相關的穩健性，文章采用多重熒光原位雜交的方法驗證兩個關鍵受配體對(LGALS9-SLC1A5 和SPP1-PTGER4) 。結果顯示受配體對相關的四個基因共定位于某些特定腫瘤區域，而非整個腫瘤空間，且來源同一受配體對的基因表達傾向于一致。兩個受配體對均高表達的患者總體生存期明顯低于低表達組，即兩個受配體對穩定高表達的HCC患者表現出較差的預后。
 

結論
文章通過多區域單細胞測序探究腫瘤各區域內和區域間異質性，進一步評估腫瘤細胞和腫瘤微環境對整個腫瘤生態貢獻，且識別出與患者預后顯著相關的分子特征。本研究揭示了惡性生態系統的穩定分子網絡，為惡性生態系統的治療探索開辟了新的途徑。

參考文獻：
Ma, L., Heinrich, S., Wang, L. et al. Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer. Nat Commun 13, 7533 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35291-5