過往的很多研究基于體外培養細胞來源的外泌體開展功能研究，這就在一定程度上有別于體內真實微環境中的外泌體，因此直接研究組織來源的外泌體在這一點上就體現出了很大的優勢。今年1月份新晉期刊Blood Cancer Discov雜志發表了一項研究腫瘤微環境來源的外泌體功能的文章[1]。該文研究了慢性淋巴細胞白血病（CLL）脾臟組織來源的外泌體影響CD8⁺T細胞的功能，減弱CD8⁺T細胞對CLL細胞的殺傷能力，從而促進CLL進展。值得一提的是該研究利用組學技術一步步挖掘外泌體的功能機制，其分析思路非常值得大家借鑒。

 

1.外泌體合成和分泌與CLL具有顯著相關性

研究人員通過分析外泌體合成和分泌途徑中相關分子的表達，試圖找到CLL和外泌體間的聯系。首先通過檢索GEO數據庫發現了CLL病人的B細胞中外泌體合成相關基因的表達要顯著高于健康人（圖1左），并且某些基因如Rab35、Rab40c在預后差的病人（IGHV_UM）中顯著高于那些預后好的病人（IGHV_M）（圖1左），這說明了CLL與更多的外泌體合成和分泌具有相關性。之后研究者納入了144例CLL患者，通過RT-qPCR檢測了7個外泌體合成和分泌相關基因的表達，鑒別了Rab27a和RAB31與預后不良顯著相關，高表達兩個基因的患者的OS顯著降低（圖1右）。這些結果說明了外泌體與CLL存在密切的關系，在CLL發生和進展中外泌體發揮著重要作用。

圖 1. 分析CLL和外泌體合成間的相關性

 

2.CLL組織微環境中含有更多的外泌體
首先研究人員提取了CLL小鼠和正常小鼠脾臟組織中的外泌體，分別定義為白血病微環境外泌體（LME-sEVs）和健康對照微環境外泌體（HCME-sEVs）。蛋白定量和粒子濃度檢測表明了CLL組織微環境中含有更多的外泌體（圖2），這與上述中外泌體合成基因在CLL中高表達呈現了很好的一致性。這些結果說明腫瘤微環境中外泌體的合成或分泌會被顯著激活。

圖2. 提取和分析脾臟來源的外泌體

 

3.CLL外泌體高表達免疫檢查點配體和腫瘤相關miRNA
首先研究人員開展了外泌體label free蛋白組學分析，結果發現很多差異蛋白與免疫過程相關，尤其是參與淋巴細胞激活、遷移和細胞因子產生等，這說明LME-sEVs可以參與微環境中免疫調節過程。引起研究人員注意的是幾個免疫檢查點配體（LGALS1、LGALS9和IL4I1）高表達在LME-sEVs中，這說明LME-sEVs或許可以抑制表達相應受體的免疫細胞活性。研究人員又通過成像流式和單囊泡流式驗證了重要的免疫檢查點配體如PD-L1和GAL9可以共表達在LME-sEVs中（圖3上）。除了這些關鍵的蛋白，研究人員又檢測了幾個已發現的在CLL等癌癥中高表達的miRNA同樣的也高表達在LME-sEVs中（圖3下）。以上這些結果說明了CLL外泌體富含參與腫瘤免疫的蛋白和miRNA，通過這些分子可以參與免疫調控。

圖3. 外泌體蛋白組學和miRNA檢測

 

4.CLL
研究人員首先通過體外和體內示蹤實驗發現了熒光標記的LME-sEVs可以被脾臟組織中的CD4⁺T_conv細胞、Treg細胞和CD8⁺T細胞攝取（圖4左）。然而相比HCME-sEVs 處理的細胞，LME-sEVs唯一能改變的是CD8⁺T細胞的轉錄組和蛋白組表達譜，這說明LME-sEVs主要作用于CD8⁺T細胞。蛋白組學分析發現了LME-sEVs處理后CD8⁺T細胞的效應蛋白顯著下調，并且很多與代謝相關的蛋白也發生了顯著性的變化（圖4左）。體外代謝指標檢測發現了LME-sEVs處理可以增加CD8⁺T細胞的葡萄糖消耗，減少氧消耗（圖4右），增加糖酵解過程，而糖酵解的增加可以抑制CD8⁺T細胞的活性，這說明LME-sEVs可以影響CD8⁺T細胞的代謝從而抑制CD8⁺T細胞活性。之后研究人員分析了CD8⁺T細胞的表型和功能，結果發現了LME-sEVs可以增加CD8⁺T細胞表達免疫檢查點受體，呈現活性抑制性表型，并且可以減弱CD8⁺T細胞對CLL細胞的毒性作用（圖4右）。

圖4.  LME-sEVs改變CD8⁺T細胞蛋白組、代謝、表型和功能

 

5.CLL外泌體通過免疫檢查點配體和miRNA共同行使功能
研究人員檢測了LME-sEVs可以通過傳遞3個重要miRNA到CD8⁺T細胞中發揮作用（圖5上）。預先在CD8⁺T細胞中轉染這些miRNA的拮抗劑后，LME-sEVs抑制CD8⁺T細胞活性的效果得到拯救（圖5上）。并且LME-sEVs被4個免疫檢查點配體（PD-L1, GAL9, VISTA, MHC-II）的抗體預先中和后，也會失去抑制CD8⁺T細胞活性的作用（圖5下）。這些結果說明了LME-sEVs通過多種功能分子對CD8⁺T細胞發揮多效的作用，從而抑制其活性。

圖5. LME-sEVs通過蛋白和miRNA調控CD8⁺T細胞活性

 

6.CLL外泌體通過抑制CD8⁺T細胞活性促進CLL進展
研究人員首先獲得了外泌體合成分子Rab27a/Rab27b突變的CLL小鼠模型，發現了外泌體合成受阻后，外周血中CLL細胞顯著減少（圖6左）；

其次在正常小鼠中注射來源于Rab27a/Rab27b突變的CLL小鼠的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞不會生長。但是同時注射LME-sEVs后，接種的CLL細胞恢復生長（圖6中）；

最后在喪失CD8⁺T細胞活性小鼠中同時接種Rab27a/Rab27b突變的CLL小鼠的腫瘤細胞和LME-sEVs處理的CD8⁺T細胞或者HCME-sEVs處理的CD8⁺T細胞，結果發現了LME-sEVs處理的CD8⁺T細胞可以顯著增加外周血中CLL細胞的數量（圖6右）。

以上體內實驗說明了腫瘤微環境中的外泌體通過抑制CD8⁺T細胞活性，減弱CD8⁺T細胞對CLL細胞的殺傷能力，從而增加體內CLL細胞的數量，促進疾病惡化。

圖6. 體內實驗驗證LME-sEVs的功能

 

總結與討論
隨著外泌體的研究越來越多，研究深度越來越深，既往外泌體常規的研究范式也會受到很大的挑戰，除了新穎性，更重要的是找到外泌體與臨床相關性的突破口。本項研究從最源頭的外泌體合成和分泌入手，找到了這一過程與臨床現象密切相關，隨機開展外泌體的機制研究。而機制研究也是摒棄了大量的細胞系實驗，聚焦利用組織來源外泌體，利用原代細胞和動物模型開展功能研究，更加貼近真實場景。利用轉錄組和蛋白組等多組學手段分析外泌體及作用的細胞，無偏倚的研究讓結果分析更加全面和準確。最后本文也提醒我們外泌體或許不只僅靠某一類分子發揮功能，而是依賴于多種分子共同執行特定的作用，所以需要同步考慮外泌體的蛋白、miRNA等其他分子。

# 關于華盈 #
上海華盈生物醫藥科技有限公司（以下簡稱“華盈生物”）成立于2012年，是外泌體研究服務領域的領導品牌，擁有外泌體研究“一站式服務”體系，覆蓋外泌體研究的方方面面，包括：外泌體的三項鑒定（電鏡、WB、NTA）、外泌體蛋白組篩選（Labelﾠfree、DIA、PRM、MRM）、外泌體核酸篩選（miRNA、全轉錄組）、外泌體納米流式檢測、外泌體細胞&動物功能實驗（PKH26/DiR/量子點、熒光示蹤）等。多年來華盈生物服務客戶已經覆蓋國內各大著名的高校院所和多位院士課題組。華盈的專業和專注也已獲得業界普遍認可，華盈生物外泌體研究合作伙伴的科研成果也先后在AdvﾠSci、JﾠClin Invest、Biomaterials、Cancer Res等著名期刊上發表。

相關文獻
Gargiulo E, Viry E, Morande PE, Largeot A, Gonder S, Xian F et al. Extracellular Vesicle Secretion by Leukemia Cells In Vivo Promotes CLL Progression by Hampering Antitumor T-cell Responses. Blood Cancer Discov. 2023;4(1):54-77.