使用ReacSight增強生物反應器陣列以實現自動測量和反應控制
跟蹤智慧實驗室的理論研究發展狀況、產業發展動態、主要設備供應商產品研發動態、國內外智慧實驗室建設成果現狀等信息內容。本文由中科院上海生命科學信息中心與曼森生物合作供稿。
本期推文， 編 譯 了 François Bertaux 等 發 表 在 Nature Communications 期刊上的研究論文《使用 ReacSight 增強生物反應器陣列以實現自動測量和反應控制》（Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight），介紹了 ReacSight，一種用于自動測量和反應實驗控制的增強生物反應器陣列的策略。ReacSight 利用低成本移液機器人進行樣品采集、處理和裝載，并提供靈活的儀器控制架構。作者展示了 ReacSight 在涉及酵母的三種實驗應用中的能力，包括：基因表達的實時光遺傳控制；營養缺乏對健康和細胞應激的影響；對雙菌株混合群落的組成進行動態控制。
目錄
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01/引言
02/結果
2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應性實驗控制
2.2 反應性光遺傳控制和酵母連續培養的單細胞解析特性
2.3 使用光實時控制基因表達
2.4 探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響
2.5 ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強平板閱讀器
03/討論
01
引言
小規模、低成本的生物反應器正在成為微生物系統和合成生物學研究的有力工具。它們允許在長時間（幾天）內嚴格控制細胞培養參數（例如溫度、細胞密度、培養基更新率）。這些獨特的特點使研究人員能夠進行復雜的實驗,并實現實驗的高度再現性。例如，當藥物選擇壓力隨著耐藥性的發展而增加時，抗生素耐藥性的表征，細胞間通信合成路徑的細胞密度控制表征，以及使用組合敲除文庫在動態變化溫度下酵母適應度的全基因組表征。
原位光密度測量只能提供總生物量濃度及其增長率的信息，而熒光測量的靈敏度低，背景高。通常還必須測量和跟蹤培養細胞群體的關鍵特征，如基因表達水平、細胞應激水平、細胞大小和形態、細胞周期進程、不同基因型或表型的比例。研究人員通常需要手動提取、處理和測量培養樣本，以便通過更靈敏和專業的儀器（如細胞儀、顯微鏡、測序儀）進行檢測。手動干預通常繁瑣、容易出錯，并嚴重限制了可用的時間分辨率和范圍（即夜間無時間點）。
它還阻礙了培養條件對此類措施的動態適應。這種反應性實驗控制目前正引起系統生物學和合成生物學的興趣。它既可以用來維持種群的某種狀態（外部反饋控制），也可以用來最大化實驗的價值（反應性實驗設計）。例如，外部反饋控制可用于解開復雜的細胞耦合和信號通路調控，控制微生物群落的組成，或優化工業生物生產。反應性實驗設計在長時間不確定實驗（如人工進化實驗）的背景下特別有用。通過實現實時參數推斷和優化實驗設計，也有助于加速基于模型的生物系統表征。
原則上，商業機器人設備和/或定制硬件可用于將生物反應器陣列連接到敏感的多樣本（通常接受 96 孔板作為輸入）測量設備。然而，這對設備采購、設備成本和軟件集成提出了巨大挑戰。當一個功能平臺建立起來時，相應硬件和軟件的升級和維護也極具挑戰性。因此，迄今為止報告的例子很少。例如，只有兩個小組展示了細菌或酵母培養物的自動細胞術和反應性光遺傳學控制，設置僅限于單個連續培養物或具有有限連續培養能力的多個培養物。一組還展示了自動顯微鏡和反應性光遺傳學控制單個酵母連續培養。
ReacSight， 一種通用且靈活的策略，用于增強生物反應器陣列的自動化測量和反應實驗控制。ReacSight 非常適合集成開放源代碼、開放硬件組件，但也可以容納封閉源代碼、 僅限 GUI 的組件（如細胞儀）。首先，作者使用 ReacSight 組裝一個平臺，實現基于細胞術的特征描述和平行酵母連續培養的反應性光遺傳學控制。重要的是，作者構建了兩個版本的平臺，要么使用定制的生物反應器陣列，要么使用最新的低成本、開放硬件、商業化的光遺傳學 Chi.生物反應器。
然后，作者在三個案例研究中證明了它的有用性。首先，作者在不同的生物反應器中用光實現基因表達的并行實時控制。第二，作者利用高度受控和信息豐富的競爭分析，探討營養缺乏對健康和細胞應激的影響。第三，作者利用平臺的養分稀缺性和反應性實驗控制能力，實現對兩個菌株混合群落的動態控制。最后，為了進一步證明 ReacSight 的通用性，作者使用它來增強具有吸液能力的平板閱讀器，并對大腸桿菌臨床分離物進行復雜的抗生素處理。
02
結果
2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應性實驗控制
ReacSight 戰略旨在增強用于自動測量和反應實驗控制的生物反應器陣列， 以靈活和標準化的方式將硬件和軟件元素結合起來（圖 1）。吸管機器人用于以通用方式在任何生物反應器陣列和任何基于平板的測量設備之間建立物理連接（圖 1a）。生物反應器培養物樣本通過連接在機械臂上的泵控取樣管線發送至移液機器人（取樣）。使用移液機器人的一個主要優點是，在測量（處理）之前，可以在培養樣本上自動執行不同的處理步驟。然后，樣品由移液機器人轉移至測量裝置（裝載）。當然，這需要測量設備的物理定位，以便當其裝載托盤打開時，機器人手臂可以接近設備輸入板的孔。部分接近設備輸入板通常不是問題，因為機器人可用于在測量之間清洗輸入板孔，允許隨著時間的推移重復使用相同的孔（清洗）。重要的是，如果不需要反應性實驗控制，或者如果不是基于測量，機器人功能也可以用于處理和存儲培養樣本，以便在實驗結束時進行一次性離線測量，從而實現具有靈活時間分辨率和范圍的自動測量。
ReacSight 還提供了一些軟件挑戰的解決方案，這些軟件挑戰應該解決，以解鎖多生物反應器的自動測量和反應實驗控制（圖 1b）。首先，需要對平臺的所有儀器（生物反應器、移液機器人、測量設備）進行程序控制。其次，一臺計算機應該與所有儀器進行通信，以協調整個實驗。ReacSight 將 Python 編程語言的多功能性和強大功能與 Flask web 應用程序框架的通用性和可伸縮性相結合，以應對這兩個挑戰。事實上，Python 非常適合輕松構建 API 來控制各種儀器：有完善的開源庫用于控制微控制器（如 Arduinos），甚至用于基于“點擊”的控制 GUI 專用軟件驅動缺少 API 的封閉源代碼儀器（pyautogui）。重要的是，開源、低成本的吸管機器人 OT-2（Opentrons）附帶了本地 Python API。Hamilton 機器人也可以通過 Python API 進行控制。然后，Flask 可用于公開所有儀器 API，以便通過本地網絡進行簡單訪問。然后，從一臺計算機協調對多個儀器的控制的任務基本上簡化為發送 HTTP 請求的簡單任務，例如使用 Python 模塊請求。HTTP 請求 還可以使用社區級數字分發平臺Discord 實現從實驗到遠程用戶的用戶友好通信。
這種多功能儀表控制結構是 ReacSight 的關鍵組件。ReacSight 的另外兩個關鍵組件是（1）通用的面向對象的事件實現（如果發生這種情況，請這樣做），以促進反應性實驗控制；（2）將所有儀器操作詳盡記錄到單個日志文件中。ReacSight 軟件以及硬件的源文件在 ReacSight-Git 存儲庫中公開提供。
圖1 ReacSight：用于自動測量和反應實驗控制的增強生物反應器陣列的策略。a 在硬件方面，ReacSight 利用吸管機器人（如低成本、開源 Opentrons OT-2）在任何多生物反應器設置（eVOLVER、Chi.Bio、custom……）和任何基于平板的測量設備（平板閱讀器、細胞儀、高通量顯微鏡、pH 計……）的輸入之間建立物理鏈接。如有必要，可使用移液機器人對生物反應器樣本進行處理（稀釋、固定、提取、純化……），然后再裝入測量裝置。如果不需要反應實驗控制，處理過的樣品也可以存儲在機器人平臺上進行離線測量（OT-2 溫度模塊可以幫助保存對溫度敏感的樣品）。b 在軟件方面，ReacSight 通過基于Python 和PythonWeb 應用程序框架 Flask 的多功能儀器控制體系結構實現了全平臺集成。ReacSight 軟件還提供了一個通用事件系統，以實現反應性實驗控制。顯示了反應實驗控制的簡單用例的示例代碼。實驗控制還可以使用Discord webhooks 將實驗狀態通知遠程用戶，并生成詳盡的日志文件。
2.2 反應性光遺傳控制和酵母連續培養的單細胞解析特性
作者首次應用 ReacSight 策略的動機是酵母合成生物學應用。在這種情況下，精確控制合成路徑并在定義明確的環境條件下測量其輸出，并具有足夠的時間分辨率和范圍是至關重要的。光遺傳學為控制合成路徑提供了一種極好的方法，生物反應器支持的連續培養是對環境條件進行長時間嚴格控制的理想方法。為了測量單個細胞的路徑輸出，細胞術提供了高靈敏度和高通量。因此，借助 ReacSight 策略，利用臺式細胞儀作為測量設備，組裝了一個完全自動化的實驗平臺，實現了對酵母連續培養物的反應性光遺傳學控制和單細胞解析表征（圖 2a）。
補充說明 2 提供了平臺硬件和軟件的詳細信息，此處僅討論關鍵要素。八個反應器與移液機器人相連，這意味著每個時間點都會填滿一列取樣板。雖然機器人可以接觸到三列細胞儀輸入板，但作者僅使用一列，由機器人進行廣泛清洗，以實現小于 0.2%的殘留，使用免疫磁珠進行驗證。通常在機器人平臺上安裝兩個傾翻箱和兩個取樣板（2×96=192 個樣本），因此，在沒有任何人為干預的情況下，八個反應器中的每一個都有 24 個時間點。為了實現基于細胞數據的反應性實驗控制，作者開發并實施了算法，以在重疊熒光團之間執行自動選通和光譜反褶積（圖 2b）。
作者首先通過對組成性表達來自染色體整合轉錄單位的各種熒光蛋白的酵母菌株進行長期恒濁培養來驗證平臺的性能（圖 2c）。熒光團水平的分布是單峰的，隨著時間的推移是穩定的，正如在具有組成型啟動子的穩定生長條件下所預期的那樣。mNeonGreen 和 mScarlet-I 在單色和三色菌株之間的分布完全重疊。這與從強 pTDH3 啟動子表達一個或三個熒光蛋白對細胞生理學的影響可以忽略不計的假設是一致的，并且三色菌株中轉錄單位的相對位置（mCerulean 第一， mNeonGreen 第二，mCarlet-I）對基因表達的影響很小。與單色品系相比，三色品系中測得的 mCerulean 水平略高（~15%）。這可能是由于反褶積中的殘余誤差造成的，與自熒光和 mNeonGreen 相比，mCerulean 的亮度較低加劇了這種誤差。為了驗證平臺的光遺傳學能力，作者構建了一個基于 EL222 系統 17 的光誘導基因表達路徑并對其進行了表征（圖 2d）。正如預期的那樣，應用不同的藍光開-關時間模式導致熒光團水平的動態分布覆蓋范圍很廣，從接近零水平（即幾乎無法與自體熒光區分）到超過強組成啟動子 pTDH3 獲得的水平。高誘導表達水平的細胞間變異性也很低，變異系數（CV）值與 pTDH3 啟動子相當（0.22 vs 0.20）。
作者組裝的第一個平臺使用了一個預先存在的定制光生生物反應器陣列。這種設置有幾個優點（可靠性、工作容量范圍廣），但其他實驗室無法輕易復制。由于 ReacSight 架構的模塊化，可以通過將這個定制的生物反應器陣列與最近描述的開放硬件、光遺傳學就緒的商用 Chi.生物反應器（圖 2a（右圖））交換，快速構建具有類似功能的平臺的第二個版本。為了驗證該平臺的另一版本的性能，作者使用圖 2d 中相同的菌株進行了光誘導實驗，并獲得了各種光誘導曲線的極好的反應器到反應器再現性。
圖 2 基于 ReacSight 的自動化平臺組裝，實現對酵母連續培養物的反應性光遺傳學控制和單 細胞解析表征。a 平臺概述。Opentrons OT-2 移液機器人用于將支持光基因的多生物反應器 連接到臺式細胞儀（Guava EasyCyte 14HT，Luminex）。機器人用于稀釋細胞儀輸入板中的 新鮮培養樣本，并在時間點之間清洗。“點擊”Python 庫 pyautogui 用于創建細胞儀儀器控制 API。定制算法是在 Python 中開發和實現的，用于實時自動選通和去卷積細胞數據。使用定 制的生物反應器裝置（左圖）或 Chi 生物反應器（右圖）組裝了兩個版本的平臺。b 選通和 反褶積算法說明。例如，顯示了重疊熒光團 mCerulean 和 mNeonGreen 之間的反褶積。c 多 代單細胞基因表達分布的穩定性。從 pTDH3 啟動子驅動的轉錄單位中組成性表達 mCerulean、 mNeonGreen 或 mCarlet-I 的菌株（“三色”菌株），整合到染色體中，在濁度調節器模式下生 長（OD 設定值=0.5，上限圖），每小時采集一次細胞儀（垂直綠線）。所有時間點的熒光強 度分布（通過高斯核密度估計進行平滑）（選通、反褶積和前向散射歸一化后，FSC）用不同 的顏色陰影繪制在一起（下圖）。RPU：相對啟動子單位（見方法）。為了簡單起見，未顯示 “三色”的 OD 數據，與其他類似。d 基于 EL222 系統的光驅動基因表達電路的特性。應用 三種不同的開-關藍光時間剖面圖（底部），每 45 分鐘采集一次細胞儀。門控、去卷積、FSC 標準化數據的中位數如圖所示（頂部）。此圖中顯示的所有生物反應器實驗均在同一天與定 制生物反應器平臺版本并行進行。源數據作為源數據文件提供。
2.3 使用光實時控制基因表達
為了展示平臺的反應性光遺傳控制能力，作者開始動態適應光刺激，以便將 熒光團水平保持在不同的目標設定點。這種用于體內基因表達調控的電子反饋有 助于在存在復雜細胞調控的情況下剖析內源性路徑的功能，并有助于將合成系統 用于生物技術應用。作者首先構建并驗證了光誘導基因表達的簡單數學模型（圖 3a）。將三個模型參數與圖 2d 的表征數據進行聯合擬合，得到了良好的定量一致 性。考慮到模型假設的簡單性，這一點值得注意：光激活下的 mRNA 生成速率 恒定，每 mRNA 的翻譯速率恒定，mRNA（大部分降解，半衰期為 20 分鐘）和 蛋白質（大部分稀釋，半衰率為 1.46 小時）的一級衰變。因此，當實驗條件得到 很好的控制并且數據得到適當的處理時，人們可以希望用一小套簡單的過程來定 量地解釋生物系統的行為。然后，作者將擬合模型合并到模型預測控制算法中（圖 3b）。該算法與 ReacSight 事件系統一起，實現了對不同反應器中不同目標的熒光 水平的精確實時控制（圖 3c）。為了進一步證明平臺的穩健性和再現性，作者在 幾個月后進行了另一個單 8 反應器實驗，涉及兩個熒光團目標水平的四個重復反 應器運行。所有的重復都能很好地跟蹤目標，并且控制算法決定的 光分布在相同目標的重復之間非常相似，但并不完全相同。
作者還研究了之前使用的誘導系統在更長時間尺度上的遺傳穩定性。遺傳穩 定性是工業生物生產的一個重要因素。作者觀察到，EL222 驅動的 mNeonGreen 蛋白的誘導可以持續 5 天以上，并且具有很好的穩定性（圖 3d 頂部）。更進一 步，作者測試了同一蛋白的分泌版本是否表現出類似的表達穩定性。作者觀察到， 誘導約2天后細胞水平顯著降低。細胞異質性也增加了（圖3d右側）。為了彌補細胞水平的下降，作者將表達盒整合成多個拷貝（三次，串聯染色體插入）。誘導后，獲得了非常高的熒光水平（圖 3d 底部）。令人驚訝的是，這些水平比非分泌蛋白高一個數量級，并伴隨著強烈的應激，正如未折疊蛋白應激報告所反映的那樣（pUPR mScarletI）。誘導后，細胞內蛋白質水平逐漸下降。細胞內蛋白質水平顯示出明顯的雙峰分布，強烈的遺傳不穩定性跡象（圖 3d 右側）。最后，當以最大誘導水平的三分之一誘導時，相同的三重拷貝結構表現出非單調行為：高水平初始反應，隨后細胞內水平緩慢下降，如完全誘導的三重結構，隨后長期內部高蛋白水平的非預期緩慢恢復（圖 3d 底部）。這種恢復可以通過細胞適應高生產需求來解釋，或者更可能的是，通過選擇高產亞群來解釋，該亞群能夠更好地保存 HIS3 選擇標記，即使在完全培養基中也具有輕微的生長優勢。這個實驗證明了作者的平臺能夠執行長時間的實驗，并以相對較高的時間分辨率提供單小區信息。此外，它促使探索和利用營養素可用性對健康和壓力的影響。
圖 3 閉環：使用光實時控制基因表達。a 光驅動基因表達電路的簡單 ODE 模型擬合到圖 2d 的表征數據。擬合參數為γm=2.09 h−1，σ=0.64 RPU 小時−1，γFP=0.475 小時−1·km 被任 意設置為等于γm，以僅允許從蛋白質中值水平識別參數。b 實時控制基因表達的策略。每 小時進行一次細胞儀采集，在選通、反褶積和 FSC 歸一化后，數據被送入模型預測控制（MPC） 算法。該算法使用該模型搜索 10 個周期為 30 分鐘的工作循環（即 5 小時的后退地平線）的 最佳占空比序列，以跟蹤目標水平。c 四種不同目標水平的實時控制結果，在不同的生物反應器中并行執行（自定義設置）。左：單個單元格的中位數（控制值）。右：單細胞隨時間的 分布。請注意，所有繪圖都使用線性比例。d 表達系統的長期穩定性和蛋白質分泌的影響。表達 EL222 驅動的 mNeonGreen 熒光報告子的細胞，無論是否分泌，在濁度調節器中生長 5 天，每 2 小時進行一次細胞儀測量。表示整個實驗期間的平均表達水平。熒光分布也顯示在 選定的時間點（誘導后 0、6、48 和 120 小時）。細胞也有分泌應激的熒光報告子（pUPRmScarlet-I）。還提供了三個拷貝中整合的 mNeonGreen 報告蛋白的分泌形式的結果。相關蛋 白（mNeonGreen 水平）和應激水平（mCarlet-I 水平）分布的時間演變如補充圖 11 和 12 所 示。源數據作為源數據文件提供。
2.4
探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響
熒光蛋白可以作為報告物來評估細胞的表型特征，也可以作為條形碼來標記具有特定基因型的菌株。再加上生物反應器陣列的自動細胞儀，這種能力擴展了可能的實驗范圍：在動態控制環境中的多重菌株特性和競爭（圖 4a）。事實上，一些熒光蛋白可用于基因分型，其他可用于表型分型。然后，自動細胞儀（包括原始數據分析）將提供關于不同菌株之間競爭動態和每個菌株的細胞狀態分布動態的定量信息。根據實驗的目標，這些豐富的信息可以反饋給實驗控制，以適應每個反應器的環境參數。
作為可以進行此類實驗的概念的第一個證明，作者開始探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響（圖 4b，左上角）。微生物群落中的不同物種根據其代謝多樣性或專業性有不同的營養需求，因此它們的適合性不僅取決于外部環境因素，還取決于群落本身通過營養物質消耗、代謝物釋放和其他細胞間耦合。與分批競爭分析相反，連續培養允許控制這些因素。例如，在恒濁器培養基中，營養素的可用性取決于營養素供應（即輸入介質中的營養素水平）和細胞的營養素消耗（主要取決于 OD 設定值）。作者使用組氨酸營養不良作為營養缺乏的模型：對于 his3 突變細胞，組氨酸是一種必需的營養素。通過將 his3 突變細胞與野生型細胞在不同 OD 設定值和喂養介質中不同組氨酸濃度下進行競爭，可以測量營養缺乏如何影響適應性（圖 4b，右上角）。在這兩個菌株中使用應激報告子也可以了解營養缺乏情況下適應性和細胞壓力之間的關系。作者將重點放在未折疊蛋白反應 （UPR）應激上，以研究營養應激是否會導致其他事先無關的應激類型，這將表明細胞生理學中的全局耦合。
組氨酸濃度為 4µM 時，在考慮的 OD 設定值（0.1-0.8）范圍內，his3 突變細胞被野生型細胞強烈競爭（圖 4b，左下角）。當濃度為 20µM 時，情況不再如此。在這種濃度下，野生型細胞的生長速度優勢在 OD 設定值 0.6 以下接近零（剩余組氨酸足以使 his3 突變細胞正常生長），在最大 OD 設定點 0.8 時超過 0.2 h −1（剩余組胺過低，限制了 his3 突變體細胞的生長）。因此，對于這種營養供應水平，細胞的營養消耗水平對 his3 突變細胞的適應性有很大影響。4µM 到 20µM 之間 的這種定性變化與組氨酸的單個高親和力轉運體 HIP1 的 Km 常數報告值 17µM 高度一致。此外，因為組氨酸濃度為 4µM 的野生型和突變型細胞之間的生長速度差異接近甚至超過野生型細胞通常觀察到的生長速度（在 0.3 到 0.45 h −1之間， 取決于 OD 設定值），作者得出結論，突變細胞在這些條件下完全生長。UPR 數據顯示，在組氨酸濃度為 20µM 的所有 OD 設定點上，突變細胞和野生型細胞之間幾乎沒有差異，但在組氨酸含量為 4µM 時，突變細胞中的 UPR 反應明顯激活 （圖 4b，右下角）。因此，看似相似的生長表型（例如 4 和 20µM OD 為 0.8 的突 變細胞）可能對應于不同的生理狀態（如不飽和蛋白反應應激水平的差異所揭示的）。
此外，為了展示基于菌株豐度數據的環境反應控制，作者著手動態控制兩個菌株的比率�？刂莆⑸锱囵B物的組成和異質性有望實現更有效的生物加工策略。作者推斷，當兩種菌株中的一種對組氨酸具有營養缺陷時，培養物的 OD 可以用作方向盤。事實上，組氨酸生物合成突變生長速率在 20µM 的中等組氨酸濃度下對 OD 的強烈依賴性（圖 4b，左下角）意味著可以通過切換恒濁器培養物的 OD 設定值來動態控制其生長速率。此外，如果這種菌株與組氨酸原營養菌菌株共同培養，但以 OD 獨立的方式生長較慢，則可以實現兩種菌株比率的雙向控制（圖 4c，左）。作者利用繁重的異源蛋白分泌構建了這種菌株。然后，作者構建了一個簡單的模型來預測組氨酸營養不良菌株的（穩態）生長速率差異。將此模型用于模型預測控制和 ReacSight 事件系統，作者可以以完全自動化的方式在平行生物反應器（圖 4c，右）中保持兩種菌株的不同比率。然而，作者注意到穩態誤差的系統存在。這種行為可能是由于慢菌株的生長速度意外恢復所致。由于在特征化實驗中未觀察到這種行為，作者假設這種差異是由于特征化或對照實驗中使用的氨基酸供應混合物的組成不同（除了組氨酸外，Sigma 的組氨酸缺失補充物比 Formedium 的完整補充物更豐富）。
圖 4 探索和利用適應性、營養缺乏和細胞應激之間的關系。a 由于共培養、自動細胞儀和反應性實驗控制，結合單細胞基因分型和表型分型的實驗得以實現，以實時適應環境條件。b 左上角：必需營養素的可用性（例如 his3 突變株的組氨酸）取決于環境供應，也取決于通過營養素消耗的細胞密度。營養素供應不足會阻礙生長速度，并可能引發細胞應激。右上角：實驗設計。野生型細胞（標記為 mCerulean 組成表達）與 his3 突變細胞共同培養。這兩個菌株都含有一個 UPR 應激報告基因 mScarlet-I 的驅動表達。自動細胞儀能夠將單個細胞分配 給其基因型，并監測菌株特異性 UPR 激活。這兩種菌株相對數量的動態可以 推斷突變細胞和野生型細胞在每種情況下的生長速度差異。左下圖：兩種不同介質組氨酸濃 度下突變細胞適應度缺陷的細胞密度依賴性。虛線表示野生型增長率對 OD 設定值的近似依賴性。右下角：每種情況下的菌株特異性 UPR 激活。c 左：雙應變聯合體的原理，其組成可以通過 OD 控制來控制。右：實施和演示。異源難折疊蛋白的分泌被用作營養獨立的慢生長表型。使用模型預測控制和 ReacSight 事件系統對 OD 設定值進行動態控制，類似于圖 3b （參見方法）。在時間 0 時開始藍光，并在整個實驗期間保持亮起，以誘導慢 his+菌株的慢 生長表型。作者注意到系統存在穩態誤差，測得的比率低于目標值。在補充注釋 3 中，作者 研究了限制控制性能的機制（慢生長表型的不穩定性、菌株識別錯誤和模型中未考慮的延 遲），還提供了其他控制實驗的結果。源數據作為源數據文件提供。
2.5
ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強平板閱讀器
為了說明 ReacSight 的通用性，將其作為通過連接實驗室設備來生長細胞和 /或測量細胞讀數以及吸管機器人來創建實驗平臺的策略，作者將 Tecan 平板閱讀器與 Opentrons 吸管機器人連接起來（圖 5a）。移液機器人和驅動讀板器的計算機通過 Flask 連接。因為無法訪問平板閱讀器的 API，所以再次使用了基于 pyautogui 的“點擊”控制策略。
在第一個應用中，作者使用移液機器人在生長條件下長時間保持細菌細胞數量。更具體地說，大腸桿菌臨床分離物在兩種不同的培養基（M9 葡萄糖加或不加 casamino 酸）中生長，并存在不同濃度的頭孢噻肟（CTX），一種β-內酰胺抗生素。由于β-內酰胺酶的表達，所選菌株對頭孢噻肟處理具有耐藥性。它對 CTX 的最低抑制濃度為 2 mg/L。當細胞群 OD 的中位數達到目標水平時，介質將按照補償蒸發的策略更新（圖 5b，左）。通過所選策略，作者能夠在至少 15 代細胞中 保持 OD 中值接近所選目標（0.05 或 0.1）（圖 5b 右圖）。有趣的是，作者觀察到，當用 1 mg/L 頭孢噻肟處理時，細胞在葡萄糖+酪氨酸鈉中的抵抗力比單獨在葡萄糖中更好。這有些令人驚訝，因為β-內酰胺類抗生素通常對快速生長的細胞有更強的影響。
在第二個應用中，作者使用該平臺測試了在不同細胞密度下應用第二劑量頭孢噻肟的效果。這些實驗在概念上非常簡單，但其結果很難預測。低濃度頭孢噻肟抑制參與細胞分裂的 PBP3 蛋白，從而導致細絲形成，而高濃度頭孢噻肟則抑制參與細胞壁維持的 PBP1 蛋白，并導致細菌溶解。由于成絲作用，即使沒有細胞分裂，種群生物量在延長的時間內也可能繼續呈指數增長。此外，死亡細胞釋 放的β-內酰胺酶在環境中降解抗生素。這導致了細胞死亡和抗生素降解之間的時間賽跑，絲狀物有助于延遲這一賽跑，同時增加生物量（圖 5c 左）。因此，在不同細胞密度下應用第二劑量抗生素的實驗有可能啟發人們理解不同的作用（圖 5c 中間）。當以 5 10−4 的光學密度開始時，單次處理的結果與分離物的 MIC 一 致，因為高于 MIC 的處理會導致生長明顯停滯，而低于 MIC 的處理不會（圖 5c， “培養基處理”）。還可以觀察到，在前一種情況下，生長在數小時后恢復，這是酶介導的抗生素耐受的典型行為。這兩個觀察結果在使用 16 mg/L CTX 進行第二次處理的情況下仍然有效。有趣的是，當處理后生長停止時，OD 大約是處理時 OD 的 25 倍：12 10−3 ,6 10−2 和 12 10−2，處理時分別為 5 10−4 , 2.5 10−3 和 5 10−3。這表明，生長停止前活細胞對抗生素的降解是有限的，因此，生長停止之前只有有限數量的細胞死亡。因此，對抗生素處理的耐受性使細胞在死亡前的生物量增加了近 25 倍，然后由于酶介導的抗生素降解，使細胞在處理中存活下來，遠遠 超過其 MIC。還可以觀察到，當初始處理為 4 mg/L 時，生長停止和再生之間的延遲相對恒定（~5 小時），與添加的抗生素總量無關（4 或 20 mg/L CTX）。這表明，生長停止后抗生素降解非常有效，延遲主要對應于無法檢測到的再生所需的時間，此時活細胞的動態被死亡生物的光密度所掩蓋。在作者的條件下，當第一次處理有效（4 或 16 mg/L）時，第二次處理似乎幾乎沒有效果。需要進行深入研究，以更量化的方式調查這些影響。
圖 5 基于 ReacSight 的自動化平臺組裝，實現反應控制和低容量細菌培養物的表征。a 平臺 概述。Opentrons OT-2 移液機器人用于提高讀板器（Spark、Tecan）的容量。機器人用于在預先定義的 OD 處處理平板讀取器中的培養物。b 左：大腸桿菌臨床分離物可以通過以 OD 控制的方式更新培養基來維持在生長條件下。必須注意補償延長時間范圍內的蒸發。右圖：富培養基中的細胞（葡萄糖+casaminoacids vs 單獨葡萄糖）生長更快，但抵抗更好的亞 MIC 抗生素處理。左：由于兩種效應的結合，細菌種群可能表現出對處理的恢復力。在單細胞水 平上，細胞可能通過絲狀化耐受超過其 MIC 的抗生素濃度。基于纖維的耐受性允許在細胞 死亡之前增加生物量。在種群水平上，抗生素被環境中細胞死亡時釋放的酶降解。最終結果 取決于細胞死亡和抗生素降解之間的競爭。中間：這兩種效應的各自作用可以通過反復抗生 素處理來研究。右圖：大腸桿菌臨床分離物在初始 OD 為 5 10−4 時用不同濃度的 CTX（圖 例）處理，第二次使用 16 mg/L CTX（紅色）或單獨使用介質（藍色），使用用戶定義的 OD （2.5 10−3 或 5 10−3 ). 由于儀器限制，OD 讀數低于 10−3 個可靠性較差。源數據作為源數據文 件提供。
03
討論
作者報道了 ReacSight 的開發，這是一種通過自動測量和反應實驗控制來增 強多生物反應器設置的策略。ReacSight 通過允許研究人員將低成本開放硬件儀器（如 eVOLVER、Chi.Bio）和多功能、模塊化、可編程移液機器人（如 Opentrons OT-2）與敏感但通常昂貴的獨立儀器相結合，構建全自動化平臺，大大拓寬了可行實驗的范圍。作者還證明，ReacSight 可用于增強具有吸液能力的平板閱讀器。ReacSight 是通用的，易于部署，應該廣泛用于微生物系統生物學和合成生物學社區。正如 Wong 及其同事所指出的，將多生物反應器裝置連接到細胞儀進行自動測量，可以實現微生物培養物的單細胞分辨特性。事實上，在微生物系統和合成生物學的背景下，自動化細胞術幾年前已經被少數實驗室證明，但低吞吐量或依賴昂貴的自動化設備可能會阻礙這項技術的廣泛采用。來自連續培養物的自動細胞儀與最近開發的光遺傳學系統相結合，變得特別強大，能夠對細胞過程進行有針對性、快速和成本效益的控制。作者使用 ReacSight 將兩種不同的生物反應器設置（預先存在的自定義設置和最近的 Chi.Bio-optogenetic-ready 生物反應器） 與細胞儀連接起來。這證明了 ReacSight 戰略的模塊化，而使用 Chi Bio 生物反應器的平臺版本說明了其他缺乏現有生物反應器設置的實驗室如何能夠以較小的時間和財務成本（不包括細胞儀的成本，盡管其價格昂貴，但即使在缺乏自動化的情況下也已經在實驗室中廣泛使用）構建這樣的平臺。作者通過以全自動方式并在不同的反應器中并行執行（1）光驅動的基因表達實時控制，展示了該平臺的關鍵能力；（2）在嚴格控制的環境條件下，基于細胞狀態的競爭分析；動態 控制兩個菌株之間的比值。
然而，作者只觸及了這些平臺提供的巨大潛在應用空間的表面。最近通過核 糖體移碼技術證明，菌株條形碼可以擴展到 20 株帶有兩個熒光團的菌株，甚至可以擴展到 100 株帶有三個熒光團。這種多路復用能力對于并行描述各種候選路徑的輸入-輸出響應（或菌株背景庫中路徑行為的依賴性）特別有用（在反應器中 使用不同的光感應）。免疫珠可用于更多樣化的基于細胞術的測量（機器人可實 現自動孵化和清洗，例如使用 Opentrons OT-2 磁性模塊）。表面顯示或 GPCR 信號等技術也可用于設計生物傳感器菌株，用單細胞儀測量更多培養物尺寸，無需試劑成本。除了高性能的定量菌株表征外，此類平臺還可用于生物技術應用�；谧詣蛹毎麅x的人工微生物聯合體的組成，以及培養條件的動態控制（如本文所示，使用組氨酸營養不良和 OD），可以大大減少設計穩健共存機制的需要，因此可以使用更大多樣性的聯合體。
未來，希望許多基于 ReacSight 的平臺將被組裝起來，它們的設計將被廣泛的社區共享，以大幅擴展實驗能力，從而解決微生物學的基本問題，并釋放合成生物學在生物技術應用中的潛力。
曼森自動化高通量發酵實驗室
曼森機器人自動化技術可根據客戶實際需求進行定制化（可實現硬件+軟件協同）完成復雜流程自動化。
機器人自動化技術與平行反應器組合為生物領域科學研究助力，是實現生物技術biofoundry的重要技術基礎；曼森生物致力于滿足客戶自動化、高通量的需求，推進合成生物技術產品快速產業化。
本期推文， 編 譯 了 François Bertaux 等 發 表 在 Nature Communications 期刊上的研究論文《使用 ReacSight 增強生物反應器陣列以實現自動測量和反應控制》（Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight），介紹了 ReacSight，一種用于自動測量和反應實驗控制的增強生物反應器陣列的策略。ReacSight 利用低成本移液機器人進行樣品采集、處理和裝載，并提供靈活的儀器控制架構。作者展示了 ReacSight 在涉及酵母的三種實驗應用中的能力，包括：基因表達的實時光遺傳控制；營養缺乏對健康和細胞應激的影響；對雙菌株混合群落的組成進行動態控制。
目錄
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01/引言
02/結果
2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應性實驗控制
2.2 反應性光遺傳控制和酵母連續培養的單細胞解析特性
2.3 使用光實時控制基因表達
2.4 探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響
2.5 ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強平板閱讀器
03/討論
01
引言
小規模、低成本的生物反應器正在成為微生物系統和合成生物學研究的有力工具。它們允許在長時間（幾天）內嚴格控制細胞培養參數（例如溫度、細胞密度、培養基更新率）。這些獨特的特點使研究人員能夠進行復雜的實驗,并實現實驗的高度再現性。例如，當藥物選擇壓力隨著耐藥性的發展而增加時，抗生素耐藥性的表征，細胞間通信合成路徑的細胞密度控制表征，以及使用組合敲除文庫在動態變化溫度下酵母適應度的全基因組表征。
原位光密度測量只能提供總生物量濃度及其增長率的信息，而熒光測量的靈敏度低，背景高。通常還必須測量和跟蹤培養細胞群體的關鍵特征，如基因表達水平、細胞應激水平、細胞大小和形態、細胞周期進程、不同基因型或表型的比例。研究人員通常需要手動提取、處理和測量培養樣本，以便通過更靈敏和專業的儀器（如細胞儀、顯微鏡、測序儀）進行檢測。手動干預通常繁瑣、容易出錯，并嚴重限制了可用的時間分辨率和范圍（即夜間無時間點）。
它還阻礙了培養條件對此類措施的動態適應。這種反應性實驗控制目前正引起系統生物學和合成生物學的興趣。它既可以用來維持種群的某種狀態（外部反饋控制），也可以用來最大化實驗的價值（反應性實驗設計）。例如，外部反饋控制可用于解開復雜的細胞耦合和信號通路調控，控制微生物群落的組成，或優化工業生物生產。反應性實驗設計在長時間不確定實驗（如人工進化實驗）的背景下特別有用。通過實現實時參數推斷和優化實驗設計，也有助于加速基于模型的生物系統表征。
原則上，商業機器人設備和/或定制硬件可用于將生物反應器陣列連接到敏感的多樣本（通常接受 96 孔板作為輸入）測量設備。然而，這對設備采購、設備成本和軟件集成提出了巨大挑戰。當一個功能平臺建立起來時，相應硬件和軟件的升級和維護也極具挑戰性。因此，迄今為止報告的例子很少。例如，只有兩個小組展示了細菌或酵母培養物的自動細胞術和反應性光遺傳學控制，設置僅限于單個連續培養物或具有有限連續培養能力的多個培養物。一組還展示了自動顯微鏡和反應性光遺傳學控制單個酵母連續培養。
ReacSight， 一種通用且靈活的策略，用于增強生物反應器陣列的自動化測量和反應實驗控制。ReacSight 非常適合集成開放源代碼、開放硬件組件，但也可以容納封閉源代碼、 僅限 GUI 的組件（如細胞儀）。首先，作者使用 ReacSight 組裝一個平臺，實現基于細胞術的特征描述和平行酵母連續培養的反應性光遺傳學控制。重要的是，作者構建了兩個版本的平臺，要么使用定制的生物反應器陣列，要么使用最新的低成本、開放硬件、商業化的光遺傳學 Chi.生物反應器。
然后，作者在三個案例研究中證明了它的有用性。首先，作者在不同的生物反應器中用光實現基因表達的并行實時控制。第二，作者利用高度受控和信息豐富的競爭分析，探討營養缺乏對健康和細胞應激的影響。第三，作者利用平臺的養分稀缺性和反應性實驗控制能力，實現對兩個菌株混合群落的動態控制。最后，為了進一步證明 ReacSight 的通用性，作者使用它來增強具有吸液能力的平板閱讀器，并對大腸桿菌臨床分離物進行復雜的抗生素處理。
02
結果
2.1 測量自動化、平臺軟件集成和 ReacSight 的反應性實驗控制
ReacSight 戰略旨在增強用于自動測量和反應實驗控制的生物反應器陣列， 以靈活和標準化的方式將硬件和軟件元素結合起來（圖 1）。吸管機器人用于以通用方式在任何生物反應器陣列和任何基于平板的測量設備之間建立物理連接（圖 1a）。生物反應器培養物樣本通過連接在機械臂上的泵控取樣管線發送至移液機器人（取樣）。使用移液機器人的一個主要優點是，在測量（處理）之前，可以在培養樣本上自動執行不同的處理步驟。然后，樣品由移液機器人轉移至測量裝置（裝載）。當然，這需要測量設備的物理定位，以便當其裝載托盤打開時，機器人手臂可以接近設備輸入板的孔。部分接近設備輸入板通常不是問題，因為機器人可用于在測量之間清洗輸入板孔，允許隨著時間的推移重復使用相同的孔（清洗）。重要的是，如果不需要反應性實驗控制，或者如果不是基于測量，機器人功能也可以用于處理和存儲培養樣本，以便在實驗結束時進行一次性離線測量，從而實現具有靈活時間分辨率和范圍的自動測量。
ReacSight 還提供了一些軟件挑戰的解決方案，這些軟件挑戰應該解決，以解鎖多生物反應器的自動測量和反應實驗控制（圖 1b）。首先，需要對平臺的所有儀器（生物反應器、移液機器人、測量設備）進行程序控制。其次，一臺計算機應該與所有儀器進行通信，以協調整個實驗。ReacSight 將 Python 編程語言的多功能性和強大功能與 Flask web 應用程序框架的通用性和可伸縮性相結合，以應對這兩個挑戰。事實上，Python 非常適合輕松構建 API 來控制各種儀器：有完善的開源庫用于控制微控制器（如 Arduinos），甚至用于基于“點擊”的控制 GUI 專用軟件驅動缺少 API 的封閉源代碼儀器（pyautogui）。重要的是，開源、低成本的吸管機器人 OT-2（Opentrons）附帶了本地 Python API。Hamilton 機器人也可以通過 Python API 進行控制。然后，Flask 可用于公開所有儀器 API，以便通過本地網絡進行簡單訪問。然后，從一臺計算機協調對多個儀器的控制的任務基本上簡化為發送 HTTP 請求的簡單任務，例如使用 Python 模塊請求。HTTP 請求 還可以使用社區級數字分發平臺Discord 實現從實驗到遠程用戶的用戶友好通信。
這種多功能儀表控制結構是 ReacSight 的關鍵組件。ReacSight 的另外兩個關鍵組件是（1）通用的面向對象的事件實現（如果發生這種情況，請這樣做），以促進反應性實驗控制；（2）將所有儀器操作詳盡記錄到單個日志文件中。ReacSight 軟件以及硬件的源文件在 ReacSight-Git 存儲庫中公開提供。
2.2 反應性光遺傳控制和酵母連續培養的單細胞解析特性
作者首次應用 ReacSight 策略的動機是酵母合成生物學應用。在這種情況下，精確控制合成路徑并在定義明確的環境條件下測量其輸出，并具有足夠的時間分辨率和范圍是至關重要的。光遺傳學為控制合成路徑提供了一種極好的方法，生物反應器支持的連續培養是對環境條件進行長時間嚴格控制的理想方法。為了測量單個細胞的路徑輸出，細胞術提供了高靈敏度和高通量。因此，借助 ReacSight 策略，利用臺式細胞儀作為測量設備，組裝了一個完全自動化的實驗平臺，實現了對酵母連續培養物的反應性光遺傳學控制和單細胞解析表征（圖 2a）。
補充說明 2 提供了平臺硬件和軟件的詳細信息，此處僅討論關鍵要素。八個反應器與移液機器人相連，這意味著每個時間點都會填滿一列取樣板。雖然機器人可以接觸到三列細胞儀輸入板，但作者僅使用一列，由機器人進行廣泛清洗，以實現小于 0.2%的殘留，使用免疫磁珠進行驗證。通常在機器人平臺上安裝兩個傾翻箱和兩個取樣板（2×96=192 個樣本），因此，在沒有任何人為干預的情況下，八個反應器中的每一個都有 24 個時間點。為了實現基于細胞數據的反應性實驗控制，作者開發并實施了算法，以在重疊熒光團之間執行自動選通和光譜反褶積（圖 2b）。
作者首先通過對組成性表達來自染色體整合轉錄單位的各種熒光蛋白的酵母菌株進行長期恒濁培養來驗證平臺的性能（圖 2c）。熒光團水平的分布是單峰的，隨著時間的推移是穩定的，正如在具有組成型啟動子的穩定生長條件下所預期的那樣。mNeonGreen 和 mScarlet-I 在單色和三色菌株之間的分布完全重疊。這與從強 pTDH3 啟動子表達一個或三個熒光蛋白對細胞生理學的影響可以忽略不計的假設是一致的，并且三色菌株中轉錄單位的相對位置（mCerulean 第一， mNeonGreen 第二，mCarlet-I）對基因表達的影響很小。與單色品系相比，三色品系中測得的 mCerulean 水平略高（~15%）。這可能是由于反褶積中的殘余誤差造成的，與自熒光和 mNeonGreen 相比，mCerulean 的亮度較低加劇了這種誤差。為了驗證平臺的光遺傳學能力，作者構建了一個基于 EL222 系統 17 的光誘導基因表達路徑并對其進行了表征（圖 2d）。正如預期的那樣，應用不同的藍光開-關時間模式導致熒光團水平的動態分布覆蓋范圍很廣，從接近零水平（即幾乎無法與自體熒光區分）到超過強組成啟動子 pTDH3 獲得的水平。高誘導表達水平的細胞間變異性也很低，變異系數（CV）值與 pTDH3 啟動子相當（0.22 vs 0.20）。
作者組裝的第一個平臺使用了一個預先存在的定制光生生物反應器陣列。這種設置有幾個優點（可靠性、工作容量范圍廣），但其他實驗室無法輕易復制。由于 ReacSight 架構的模塊化，可以通過將這個定制的生物反應器陣列與最近描述的開放硬件、光遺傳學就緒的商用 Chi.生物反應器（圖 2a（右圖））交換，快速構建具有類似功能的平臺的第二個版本。為了驗證該平臺的另一版本的性能，作者使用圖 2d 中相同的菌株進行了光誘導實驗，并獲得了各種光誘導曲線的極好的反應器到反應器再現性。
2.3 使用光實時控制基因表達
為了展示平臺的反應性光遺傳控制能力，作者開始動態適應光刺激，以便將 熒光團水平保持在不同的目標設定點。這種用于體內基因表達調控的電子反饋有 助于在存在復雜細胞調控的情況下剖析內源性路徑的功能，并有助于將合成系統 用于生物技術應用。作者首先構建并驗證了光誘導基因表達的簡單數學模型（圖 3a）。將三個模型參數與圖 2d 的表征數據進行聯合擬合，得到了良好的定量一致 性。考慮到模型假設的簡單性，這一點值得注意：光激活下的 mRNA 生成速率 恒定，每 mRNA 的翻譯速率恒定，mRNA（大部分降解，半衰期為 20 分鐘）和 蛋白質（大部分稀釋，半衰率為 1.46 小時）的一級衰變。因此，當實驗條件得到 很好的控制并且數據得到適當的處理時，人們可以希望用一小套簡單的過程來定 量地解釋生物系統的行為。然后，作者將擬合模型合并到模型預測控制算法中（圖 3b）。該算法與 ReacSight 事件系統一起，實現了對不同反應器中不同目標的熒光 水平的精確實時控制（圖 3c）。為了進一步證明平臺的穩健性和再現性，作者在 幾個月后進行了另一個單 8 反應器實驗，涉及兩個熒光團目標水平的四個重復反 應器運行。所有的重復都能很好地跟蹤目標，并且控制算法決定的 光分布在相同目標的重復之間非常相似，但并不完全相同。
作者還研究了之前使用的誘導系統在更長時間尺度上的遺傳穩定性。遺傳穩 定性是工業生物生產的一個重要因素。作者觀察到，EL222 驅動的 mNeonGreen 蛋白的誘導可以持續 5 天以上，并且具有很好的穩定性（圖 3d 頂部）。更進一 步，作者測試了同一蛋白的分泌版本是否表現出類似的表達穩定性。作者觀察到， 誘導約2天后細胞水平顯著降低。細胞異質性也增加了（圖3d右側）。為了彌補細胞水平的下降，作者將表達盒整合成多個拷貝（三次，串聯染色體插入）。誘導后，獲得了非常高的熒光水平（圖 3d 底部）。令人驚訝的是，這些水平比非分泌蛋白高一個數量級，并伴隨著強烈的應激，正如未折疊蛋白應激報告所反映的那樣（pUPR mScarletI）。誘導后，細胞內蛋白質水平逐漸下降。細胞內蛋白質水平顯示出明顯的雙峰分布，強烈的遺傳不穩定性跡象（圖 3d 右側）。最后，當以最大誘導水平的三分之一誘導時，相同的三重拷貝結構表現出非單調行為：高水平初始反應，隨后細胞內水平緩慢下降，如完全誘導的三重結構，隨后長期內部高蛋白水平的非預期緩慢恢復（圖 3d 底部）。這種恢復可以通過細胞適應高生產需求來解釋，或者更可能的是，通過選擇高產亞群來解釋，該亞群能夠更好地保存 HIS3 選擇標記，即使在完全培養基中也具有輕微的生長優勢。這個實驗證明了作者的平臺能夠執行長時間的實驗，并以相對較高的時間分辨率提供單小區信息。此外，它促使探索和利用營養素可用性對健康和壓力的影響。
2.4
探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響
熒光蛋白可以作為報告物來評估細胞的表型特征，也可以作為條形碼來標記具有特定基因型的菌株。再加上生物反應器陣列的自動細胞儀，這種能力擴展了可能的實驗范圍：在動態控制環境中的多重菌株特性和競爭（圖 4a）。事實上，一些熒光蛋白可用于基因分型，其他可用于表型分型。然后，自動細胞儀（包括原始數據分析）將提供關于不同菌株之間競爭動態和每個菌株的細胞狀態分布動態的定量信息。根據實驗的目標，這些豐富的信息可以反饋給實驗控制，以適應每個反應器的環境參數。
作為可以進行此類實驗的概念的第一個證明，作者開始探索營養缺乏對健康和細胞壓力的影響（圖 4b，左上角）。微生物群落中的不同物種根據其代謝多樣性或專業性有不同的營養需求，因此它們的適合性不僅取決于外部環境因素，還取決于群落本身通過營養物質消耗、代謝物釋放和其他細胞間耦合。與分批競爭分析相反，連續培養允許控制這些因素。例如，在恒濁器培養基中，營養素的可用性取決于營養素供應（即輸入介質中的營養素水平）和細胞的營養素消耗（主要取決于 OD 設定值）。作者使用組氨酸營養不良作為營養缺乏的模型：對于 his3 突變細胞，組氨酸是一種必需的營養素。通過將 his3 突變細胞與野生型細胞在不同 OD 設定值和喂養介質中不同組氨酸濃度下進行競爭，可以測量營養缺乏如何影響適應性（圖 4b，右上角）。在這兩個菌株中使用應激報告子也可以了解營養缺乏情況下適應性和細胞壓力之間的關系。作者將重點放在未折疊蛋白反應 （UPR）應激上，以研究營養應激是否會導致其他事先無關的應激類型，這將表明細胞生理學中的全局耦合。
組氨酸濃度為 4µM 時，在考慮的 OD 設定值（0.1-0.8）范圍內，his3 突變細胞被野生型細胞強烈競爭（圖 4b，左下角）。當濃度為 20µM 時，情況不再如此。在這種濃度下，野生型細胞的生長速度優勢在 OD 設定值 0.6 以下接近零（剩余組氨酸足以使 his3 突變細胞正常生長），在最大 OD 設定點 0.8 時超過 0.2 h −1（剩余組胺過低，限制了 his3 突變體細胞的生長）。因此，對于這種營養供應水平，細胞的營養消耗水平對 his3 突變細胞的適應性有很大影響。4µM 到 20µM 之間 的這種定性變化與組氨酸的單個高親和力轉運體 HIP1 的 Km 常數報告值 17µM 高度一致。此外，因為組氨酸濃度為 4µM 的野生型和突變型細胞之間的生長速度差異接近甚至超過野生型細胞通常觀察到的生長速度（在 0.3 到 0.45 h −1之間， 取決于 OD 設定值），作者得出結論，突變細胞在這些條件下完全生長。UPR 數據顯示，在組氨酸濃度為 20µM 的所有 OD 設定點上，突變細胞和野生型細胞之間幾乎沒有差異，但在組氨酸含量為 4µM 時，突變細胞中的 UPR 反應明顯激活 （圖 4b，右下角）。因此，看似相似的生長表型（例如 4 和 20µM OD 為 0.8 的突 變細胞）可能對應于不同的生理狀態（如不飽和蛋白反應應激水平的差異所揭示的）。
此外，為了展示基于菌株豐度數據的環境反應控制，作者著手動態控制兩個菌株的比率�？刂莆⑸锱囵B物的組成和異質性有望實現更有效的生物加工策略。作者推斷，當兩種菌株中的一種對組氨酸具有營養缺陷時，培養物的 OD 可以用作方向盤。事實上，組氨酸生物合成突變生長速率在 20µM 的中等組氨酸濃度下對 OD 的強烈依賴性（圖 4b，左下角）意味著可以通過切換恒濁器培養物的 OD 設定值來動態控制其生長速率。此外，如果這種菌株與組氨酸原營養菌菌株共同培養，但以 OD 獨立的方式生長較慢，則可以實現兩種菌株比率的雙向控制（圖 4c，左）。作者利用繁重的異源蛋白分泌構建了這種菌株。然后，作者構建了一個簡單的模型來預測組氨酸營養不良菌株的（穩態）生長速率差異。將此模型用于模型預測控制和 ReacSight 事件系統，作者可以以完全自動化的方式在平行生物反應器（圖 4c，右）中保持兩種菌株的不同比率。然而，作者注意到穩態誤差的系統存在。這種行為可能是由于慢菌株的生長速度意外恢復所致。由于在特征化實驗中未觀察到這種行為，作者假設這種差異是由于特征化或對照實驗中使用的氨基酸供應混合物的組成不同（除了組氨酸外，Sigma 的組氨酸缺失補充物比 Formedium 的完整補充物更豐富）。
2.5
ReacSight 是一種通用策略：通過吸液功能增強平板閱讀器
為了說明 ReacSight 的通用性，將其作為通過連接實驗室設備來生長細胞和 /或測量細胞讀數以及吸管機器人來創建實驗平臺的策略，作者將 Tecan 平板閱讀器與 Opentrons 吸管機器人連接起來（圖 5a）。移液機器人和驅動讀板器的計算機通過 Flask 連接。因為無法訪問平板閱讀器的 API，所以再次使用了基于 pyautogui 的“點擊”控制策略。
在第一個應用中，作者使用移液機器人在生長條件下長時間保持細菌細胞數量。更具體地說，大腸桿菌臨床分離物在兩種不同的培養基（M9 葡萄糖加或不加 casamino 酸）中生長，并存在不同濃度的頭孢噻肟（CTX），一種β-內酰胺抗生素。由于β-內酰胺酶的表達，所選菌株對頭孢噻肟處理具有耐藥性。它對 CTX 的最低抑制濃度為 2 mg/L。當細胞群 OD 的中位數達到目標水平時，介質將按照補償蒸發的策略更新（圖 5b，左）。通過所選策略，作者能夠在至少 15 代細胞中 保持 OD 中值接近所選目標（0.05 或 0.1）（圖 5b 右圖）。有趣的是，作者觀察到，當用 1 mg/L 頭孢噻肟處理時，細胞在葡萄糖+酪氨酸鈉中的抵抗力比單獨在葡萄糖中更好。這有些令人驚訝，因為β-內酰胺類抗生素通常對快速生長的細胞有更強的影響。
在第二個應用中，作者使用該平臺測試了在不同細胞密度下應用第二劑量頭孢噻肟的效果。這些實驗在概念上非常簡單，但其結果很難預測。低濃度頭孢噻肟抑制參與細胞分裂的 PBP3 蛋白，從而導致細絲形成，而高濃度頭孢噻肟則抑制參與細胞壁維持的 PBP1 蛋白，并導致細菌溶解。由于成絲作用，即使沒有細胞分裂，種群生物量在延長的時間內也可能繼續呈指數增長。此外，死亡細胞釋 放的β-內酰胺酶在環境中降解抗生素。這導致了細胞死亡和抗生素降解之間的時間賽跑，絲狀物有助于延遲這一賽跑，同時增加生物量（圖 5c 左）。因此，在不同細胞密度下應用第二劑量抗生素的實驗有可能啟發人們理解不同的作用（圖 5c 中間）。當以 5 10−4 的光學密度開始時，單次處理的結果與分離物的 MIC 一 致，因為高于 MIC 的處理會導致生長明顯停滯，而低于 MIC 的處理不會（圖 5c， “培養基處理”）。還可以觀察到，在前一種情況下，生長在數小時后恢復，這是酶介導的抗生素耐受的典型行為。這兩個觀察結果在使用 16 mg/L CTX 進行第二次處理的情況下仍然有效。有趣的是，當處理后生長停止時，OD 大約是處理時 OD 的 25 倍：12 10−3 ,6 10−2 和 12 10−2，處理時分別為 5 10−4 , 2.5 10−3 和 5 10−3。這表明，生長停止前活細胞對抗生素的降解是有限的，因此，生長停止之前只有有限數量的細胞死亡。因此，對抗生素處理的耐受性使細胞在死亡前的生物量增加了近 25 倍，然后由于酶介導的抗生素降解，使細胞在處理中存活下來，遠遠 超過其 MIC。還可以觀察到，當初始處理為 4 mg/L 時，生長停止和再生之間的延遲相對恒定（~5 小時），與添加的抗生素總量無關（4 或 20 mg/L CTX）。這表明，生長停止后抗生素降解非常有效，延遲主要對應于無法檢測到的再生所需的時間，此時活細胞的動態被死亡生物的光密度所掩蓋。在作者的條件下，當第一次處理有效（4 或 16 mg/L）時，第二次處理似乎幾乎沒有效果。需要進行深入研究，以更量化的方式調查這些影響。
03
討論
作者報道了 ReacSight 的開發，這是一種通過自動測量和反應實驗控制來增 強多生物反應器設置的策略。ReacSight 通過允許研究人員將低成本開放硬件儀器（如 eVOLVER、Chi.Bio）和多功能、模塊化、可編程移液機器人（如 Opentrons OT-2）與敏感但通常昂貴的獨立儀器相結合，構建全自動化平臺，大大拓寬了可行實驗的范圍。作者還證明，ReacSight 可用于增強具有吸液能力的平板閱讀器。ReacSight 是通用的，易于部署，應該廣泛用于微生物系統生物學和合成生物學社區。正如 Wong 及其同事所指出的，將多生物反應器裝置連接到細胞儀進行自動測量，可以實現微生物培養物的單細胞分辨特性。事實上，在微生物系統和合成生物學的背景下，自動化細胞術幾年前已經被少數實驗室證明，但低吞吐量或依賴昂貴的自動化設備可能會阻礙這項技術的廣泛采用。來自連續培養物的自動細胞儀與最近開發的光遺傳學系統相結合，變得特別強大，能夠對細胞過程進行有針對性、快速和成本效益的控制。作者使用 ReacSight 將兩種不同的生物反應器設置（預先存在的自定義設置和最近的 Chi.Bio-optogenetic-ready 生物反應器） 與細胞儀連接起來。這證明了 ReacSight 戰略的模塊化，而使用 Chi Bio 生物反應器的平臺版本說明了其他缺乏現有生物反應器設置的實驗室如何能夠以較小的時間和財務成本（不包括細胞儀的成本，盡管其價格昂貴，但即使在缺乏自動化的情況下也已經在實驗室中廣泛使用）構建這樣的平臺。作者通過以全自動方式并在不同的反應器中并行執行（1）光驅動的基因表達實時控制，展示了該平臺的關鍵能力；（2）在嚴格控制的環境條件下，基于細胞狀態的競爭分析；動態 控制兩個菌株之間的比值。
然而，作者只觸及了這些平臺提供的巨大潛在應用空間的表面。最近通過核 糖體移碼技術證明，菌株條形碼可以擴展到 20 株帶有兩個熒光團的菌株，甚至可以擴展到 100 株帶有三個熒光團。這種多路復用能力對于并行描述各種候選路徑的輸入-輸出響應（或菌株背景庫中路徑行為的依賴性）特別有用（在反應器中 使用不同的光感應）。免疫珠可用于更多樣化的基于細胞術的測量（機器人可實 現自動孵化和清洗，例如使用 Opentrons OT-2 磁性模塊）。表面顯示或 GPCR 信號等技術也可用于設計生物傳感器菌株，用單細胞儀測量更多培養物尺寸，無需試劑成本。除了高性能的定量菌株表征外，此類平臺還可用于生物技術應用�；谧詣蛹毎麅x的人工微生物聯合體的組成，以及培養條件的動態控制（如本文所示，使用組氨酸營養不良和 OD），可以大大減少設計穩健共存機制的需要，因此可以使用更大多樣性的聯合體。
未來，希望許多基于 ReacSight 的平臺將被組裝起來，它們的設計將被廣泛的社區共享，以大幅擴展實驗能力，從而解決微生物學的基本問題，并釋放合成生物學在生物技術應用中的潛力。
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文章來源：本文由中科院上海生命科學信息中心與曼森生物合作供稿
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