柯薩奇病毒A16(CVA16)是小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的成員，是嬰幼兒中流行的手足口病 (HFMD)的主要病原體之一。CVA16感染可能導致自限性疾病以及嚴重的臨床結(jié)果，例如腦炎、心肌炎、肺炎，甚至死亡。此外，CVA16經(jīng)常與其他引起手足口病的病原體共同傳播，例如人類腸道病毒A71(EV71)、柯薩奇病毒A6(CVA6)和柯薩奇病毒A10(CVA10)，導致共同感染和病毒基因重組，這使得防控手足口病更具挑戰(zhàn)性。
 
01 研究初衷
2022年12月21日，中國科學院分子病毒學與免疫學重點實驗室Chao Zhang團隊在Nature上發(fā)表一篇名為《Molecular mechanism of antibody neutralization of coxsackievirus A16》的文章，他們設計實驗的初衷是研究兩種 CVA16 特異性中和單克隆抗體 (MAb) 9B5 和 8C4 的功能和工作機制，從而改善目前沒有可用于柯薩奇病毒CVA16 的疫苗或抗病毒劑的困境。

02針對 CVA16 的中和 MAb 的鑒定
 為了制備CVA16 特異性中和MAb，用滅活CVA16（菌株SZ05）免疫小鼠，從中產(chǎn)生雜交瘤細胞，獲得了三個具有中和活性的穩(wěn)定雜交瘤單克隆（8C4、9B5和9G1）。分別測試了同種型和中和作用、細胞活力、病毒顆粒的結(jié)合動力學等參數(shù)。
  圖1：抗 CVA16 MAb 的中和、結(jié)合親和力和相互競爭
 
根據(jù)結(jié)合競爭的結(jié)果，三個MAbs可以被分為兩個非競爭性的抗體組：第1組由9B5和9G1組成，第2組由8C4單獨構(gòu)成。MAb 9B5比第1組中的9G1和第2組中的8C4具有更強的中和作用，被選為兩個抗體組的代表進行后續(xù)深入分析。
 
03 8C4和9B5的預防和治療功效
給幾組剛出生1天的 ICR 小鼠注射 PBS、10 mg/kg 的抗 CVA16 單克隆抗體 8C4 或 9B5、8C4 和 9B5 的組合（每種抗體 10 mg/kg），或10 mg/kg 的 IgG 對照抗體 2H2。二十四小時后，小鼠受到 CVA16/MAV 病毒攻擊，每天記錄小鼠的生命狀態(tài)和臨床評分。 圖2：抗 CVA16 MAb 的體內(nèi)保護功效
 
除了一只小鼠以外，所有用 8C4、9B5 或 8C4 + 9B5 組合處理的小鼠都表現(xiàn)出健康的生命體征。這些數(shù)據(jù)證明了 8C4、9B5 和 8C4 + 9B5 組合的起到有效的體內(nèi)預防功效。
 
04 MAb 8C4 和 9B5 的中和機制
 進行MAb 在哪個步驟發(fā)揮抗病毒作用確定。簡而言之，培養(yǎng)的細胞要么與單個 MAb 預混合的 CVA16（附著前）接種，要么在病毒附著后（ 4 °C）的不同時間點用 MAb 處理細胞（附著后）。然后，在感染后 6 小時分析細胞的相對病毒 RNA 水平。 圖3：MAb 的中和機制

結(jié)果表明，附著后 0.5 小時是 8C4 進行中和作用的關(guān)鍵添加時間點，因此 8C4 可能會在病毒進入附著后的早期階段進行阻斷，9B5主要在感染的附著前階段發(fā)揮中和作用。

05 8C4/9B5 混合物可防止病毒逃逸
  CVA16-9B5 C1 和 CVA16-8C4 C1 的冷凍電鏡圖疊加顯示 8C4 和 9B5 識別不同的、不重疊的表位，因此可能同時結(jié)合相同的表位CVA16 病毒衣殼。因此，這兩種 MAb 可以用作非競爭抗體對。通過以 1:1 的比例混合兩種抗體來制備 8C4/9B5 混合物，并分析針對 CVA16/SZ05 的中和作用。
 
圖4：MAb 8C4 和 9B5 的組合可防止 CVA16 病毒逃逸突變
8C4/9B5 cocktail 的中和活性略強于單獨的 9B5，表明 8C4 與 9B5 聯(lián)合使用時具有相容性。
 
綜上所述，我們的研究清楚地定義了針對衣殼五重和三重頂點的兩組 CVA16 特異性中和 MAb 的功能和工作機制，并證明了 9B5/8C4 抗體混合物顯示出更高的中和效力，并獲得了一種獨特的能力來防止病毒逃逸，這在單個抗體中是可見的。這些發(fā)現(xiàn)對抗 CVA16 疫苗和療法的設計和開發(fā)具有重要意義。