實時活細胞成像技術(shù)在臨床醫(yī)學中的應(yīng)用
先天性心臟病等心臟大血管疾病患者需要外科手術(shù)治療。心臟外科手術(shù)需要在心臟停跳狀態(tài)下進行，而在心臟停跳過程中，不可避免地會出現(xiàn)不同程度的心肌損傷。應(yīng)用心臟停搏液不僅可以在手術(shù)過程中誘導心臟快速停跳、保持心臟停跳期間的心臟靜止狀態(tài)、縮短心臟停跳時間，更大限度減少心肌損傷、維護正常的心臟功能，其優(yōu)劣還可以直接影響手術(shù)效果。目前，許多臨床試驗比較了不同的心臟停搏液和心臟保護方案，但鮮有文章對體外條件培養(yǎng)的細胞進行研究。
本研究采用新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對作為體外模型的大鼠心肌細胞進行長時間成像和分析，評估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細胞效應(yīng)，并且預估了心臟細胞的安全暴露時間，這個結(jié)果對心臟保護和心臟外科手術(shù)中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價值。
實驗方法
將大鼠心肌細胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細胞核抗原表達（PCNA）在置于細胞培養(yǎng)箱中的活細胞成像平臺CellCyte X上測定細胞的活力、匯合性、細胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對細胞形態(tài)的影響。
實驗結(jié)果
1.細胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對H9C2細胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗證。
CellCyte X成像研究表明，短時間的暴露不會影響細胞的生存和匯合（圖1）。在2h時細胞的活力是對照未處理細胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時間，此后匯流開始下降（圖1b）。細胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細胞體積增加，腫脹，并在24小時內(nèi)保持不變（圖1c）。同時，我們觀察到了初始細胞體積的差異，這可能與實驗程序方案有關(guān)，實驗組細胞在測量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預孵育時間可能會導致細胞腫脹并保持24小時，我們觀察到正常的細胞體積在同一時間內(nèi)保持不變。
2.心臟停搏液對心肌細胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對照未處理細胞相比，心肌細胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細胞體積結(jié)果相符，但細胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對照細胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對H9C2細胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時間依賴性。
圖3展示了H9C2細胞的三維視圖，可見無擾動形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長的孵育時間才導致空泡化增加。接著，在24小時后測量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時間越長，對H9C2細胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細胞腫脹有關(guān)。然后通過免疫染色反應(yīng)來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標記物PCNA和Ki67表達增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應(yīng)的細胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細胞中檢測到免疫染色反應(yīng)，其中24h時免疫染色反應(yīng)最強烈。
圖2.H9C2細胞的透射電鏡圖 （a）未處理對照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細胞質(zhì)M：線粒體，N：細胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標記物染色的藍色細胞核
圖4.用ST2C孵育24小時后，大鼠成肌細胞中作為蛋白質(zhì)損傷標志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細胞中PCNA表達的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細胞中Ki67表達的分析（*p<0.05）
實驗結(jié)論
使用活細胞成像平臺CellCyte X 對體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標記物（PCNA和Ki67）來保護和維持H9C2大鼠心肌細胞，且不會對形態(tài)學造成顯著的形態(tài)學變化。但是對于敏感的新生兒成肌細胞，保護時間限制在4小時內(nèi)。本次實驗結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對保護心肌細胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟且簡單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學領(lǐng)域中的成像優(yōu)勢
新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學提供自動化的、連續(xù)的動態(tài)細胞生長分析:
一、提高細胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實驗過程中對細胞的干擾
二、實時收集與分析數(shù)據(jù)：在整個實驗過程中，可實時對數(shù)據(jù)進行收集與處理
三、通量高：可同時放置6塊微孔板，更大限度滿足您對實驗通量的需求
四、開放式設(shè)計：便于對細胞生長環(huán)境的維持，提高了實驗環(huán)境的可控性與更佳的細胞狀態(tài)
五、軟件平臺簡潔直觀：直觀的成像與分析界面設(shè)計，方便使用者學習與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強的輪廓成像模式，除了明場還有紅、藍、綠3色熒光通道，讓實驗可進行多重復用
七、數(shù)據(jù)分析功能強大：每次實驗可根據(jù)需求采集存儲數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設(shè)計緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計緊湊，易于安裝與維護，大幅降低了維護成本
如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
本研究采用新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對作為體外模型的大鼠心肌細胞進行長時間成像和分析，評估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細胞效應(yīng)，并且預估了心臟細胞的安全暴露時間，這個結(jié)果對心臟保護和心臟外科手術(shù)中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價值。
實驗方法
將大鼠心肌細胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細胞核抗原表達（PCNA）在置于細胞培養(yǎng)箱中的活細胞成像平臺CellCyte X上測定細胞的活力、匯合性、細胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對細胞形態(tài)的影響。
實驗結(jié)果
1.細胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對H9C2細胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗證。
CellCyte X成像研究表明，短時間的暴露不會影響細胞的生存和匯合（圖1）。在2h時細胞的活力是對照未處理細胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時間，此后匯流開始下降（圖1b）。細胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細胞體積增加，腫脹，并在24小時內(nèi)保持不變（圖1c）。同時，我們觀察到了初始細胞體積的差異，這可能與實驗程序方案有關(guān)，實驗組細胞在測量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預孵育時間可能會導致細胞腫脹并保持24小時，我們觀察到正常的細胞體積在同一時間內(nèi)保持不變。
圖1.ST2C對H9C2細胞的影響
- MTT法測定存活率；（b）細胞匯合性；（c）暴露24h后的細胞體積；可行性結(jié)果表示為平均值±SD。單向方差分析：*p<0.05，**p>0.005。
2.心臟停搏液對心肌細胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對照未處理細胞相比，心肌細胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細胞體積結(jié)果相符，但細胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對照細胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對H9C2細胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時間依賴性。
圖3展示了H9C2細胞的三維視圖，可見無擾動形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長的孵育時間才導致空泡化增加。接著，在24小時后測量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時間越長，對H9C2細胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細胞腫脹有關(guān)。然后通過免疫染色反應(yīng)來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標記物PCNA和Ki67表達增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應(yīng)的細胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細胞中檢測到免疫染色反應(yīng)，其中24h時免疫染色反應(yīng)最強烈。
圖2.H9C2細胞的透射電鏡圖 （a）未處理對照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細胞質(zhì)M：線粒體，N：細胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標記物染色的藍色細胞核
圖4.用ST2C孵育24小時后，大鼠成肌細胞中作為蛋白質(zhì)損傷標志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細胞中PCNA表達的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細胞中Ki67表達的分析（*p<0.05）
實驗結(jié)論
使用活細胞成像平臺CellCyte X 對體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標記物（PCNA和Ki67）來保護和維持H9C2大鼠心肌細胞，且不會對形態(tài)學造成顯著的形態(tài)學變化。但是對于敏感的新生兒成肌細胞，保護時間限制在4小時內(nèi)。本次實驗結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對保護心肌細胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟且簡單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學領(lǐng)域中的成像優(yōu)勢
圖5. CellCyte X儀器
新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學提供自動化的、連續(xù)的動態(tài)細胞生長分析:
一、提高細胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實驗過程中對細胞的干擾
二、實時收集與分析數(shù)據(jù)：在整個實驗過程中，可實時對數(shù)據(jù)進行收集與處理
三、通量高：可同時放置6塊微孔板，更大限度滿足您對實驗通量的需求
四、開放式設(shè)計：便于對細胞生長環(huán)境的維持，提高了實驗環(huán)境的可控性與更佳的細胞狀態(tài)
五、軟件平臺簡潔直觀：直觀的成像與分析界面設(shè)計，方便使用者學習與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強的輪廓成像模式，除了明場還有紅、藍、綠3色熒光通道，讓實驗可進行多重復用
七、數(shù)據(jù)分析功能強大：每次實驗可根據(jù)需求采集存儲數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設(shè)計緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計緊湊，易于安裝與維護，大幅降低了維護成本
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