使用RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

瀏覽次數(shù)：1974　發(fā)布日期：2023-1-6　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、PCR：

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發(fā)明，至今仍廣泛使用的DNA擴(kuò)增技術(shù)。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫擴(kuò)增的過程，來實現(xiàn)目標(biāo)片段DNA的指數(shù)級擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系可以簡單概括為：DNA模板（Template）、引物（Primer）、DNA聚合酶（Polymerase）、三磷酸核苷（dNTPs）及緩沖液。緩沖液中常含氯化鎂等金屬鹽，并可能添加BSA、DTT、甲酰胺等助于聚合酶活性和模板解鏈的試劑，并以PreMix、MasterMix的形式商品化，耐思通用型核酸擴(kuò)增試劑盒可滿足常規(guī)PCR需求。

PCR熱循環(huán)儀是實現(xiàn)PCR反應(yīng)的外部硬件，通過程序化的溫度控制，利用金屬浴來按時加熱、冷卻PCR反應(yīng)體系。DNA雙鏈模板中的氫鍵在高溫下斷裂；溫度降低后，體系中互補引物與模板單鏈重新形成氫鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生粘性末端。DNA聚合酶辨識粘性末端結(jié)合后，在中等溫度下以dNTP為原料在引物后延長DNA鏈。如此產(chǎn)生的DNA鏈在新的一輪循環(huán)中可以作為額外的模板重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)，若干循環(huán)后目標(biāo)DNA片段便實現(xiàn)指數(shù)級擴(kuò)增。

實驗案例：一個經(jīng)典的實驗室PCR實驗

PCR體系的組成：DNA模板（<100ng）、上下游引物（2mM）、dNTPs（2mM）、DNA聚合酶MasterMix（2X）。PCR體系常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。一個典型的PCR程序如下：

二、qPCR、RT-PCR、數(shù)字PCR：

傳統(tǒng)PCR技術(shù)僅在終點處檢測產(chǎn)物，因此也叫終點PCR（End-point PCR），常用于克隆、測序及基因分型等。而與之相對應(yīng)的，在整個反應(yīng)中都檢測目標(biāo)序列熒光信號的技術(shù)稱為實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR），簡稱qPCR。qPCR的檢測能力、應(yīng)用范圍相對于終點PCR都有很大的提高。

qPCR中有嵌入或基于探針的熒光染料在循環(huán)中實時反應(yīng)產(chǎn)物濃度。一系列從低到高濃度的DNA模板參照會與目標(biāo)模板同步擴(kuò)增，較高濃度的DNA模板在擴(kuò)增過程中會更快達(dá)到檢測閾值，而擁有較小的CT值（Cycle Threshold）。反應(yīng)結(jié)束后通過繪制對照DNA模板濃度與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算目標(biāo)模板初始的濃度，實現(xiàn)樣品中DNA定量的目的。qPCR的應(yīng)用包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測、基因診斷、腫瘤載量及治療效率檢測等。

基于qPCR的RNA定量技術(shù)稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcriptase PCR），寫為RT-PCR。（由于“實時”與“逆轉(zhuǎn)錄”的英文縮寫均為RT，為避免混淆，通常“實時”小寫為rt，“逆轉(zhuǎn)錄”大寫為RT。）RT-PCR通過逆轉(zhuǎn)錄RNA形成互補DNA（Complementary DNA，cDNA）后以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病毒載量檢測等。

模擬實驗：標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

檢測新冠病毒的引物和檢測探針序列設(shè)計可以圍繞包膜（Envelope，E）、核衣殼（Nucleocapsid，N）、RNA聚合酶（RdRp）或復(fù)制酶基因（ORF1ab），其中N和ORF1ab的序列在中國疾控中心的網(wǎng)站上有公開。

1. 使用鼻咽拭子在鼻粘膜或咽部采樣，置于2mL病毒轉(zhuǎn)移液（VTM）采樣管中

2. 取采樣后的樣品液200μL使用RNA提取試劑盒提取樣品，大量樣品可以使用磁珠法病原微生物基因組核酸提取試劑盒及配套儀器自動提取。

3. 使用2.5×RT-qPCR預(yù)混液(多重-探針法）試劑盒中的預(yù)混液（10μL）與引物、探針（5μL）和提取樣品（10μL）配置25μL反應(yīng)體系，同步準(zhǔn)備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照體系。

4. 熱循環(huán)儀的程序可大致設(shè)定為55℃ 5min逆轉(zhuǎn)錄，95℃ 5min預(yù)變性，45個擴(kuò)增循環(huán)：95℃ 5sec、60℃ 15sec、72℃ 15sec。進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

5. 最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中RNA模板的濃度，參照CT值標(biāo)準(zhǔn)判斷是否陽性。

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是基于終點PCR與qPCR發(fā)展而來的第三代核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用統(tǒng)計學(xué)方法實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。數(shù)字PCR可以理解為將一個終點PCR體系分散成數(shù)以萬計的微PCR反應(yīng)，每個微系統(tǒng)體積為納米級，且理論上僅含若干個、1或0個目標(biāo)核酸分子。在熱循環(huán)反應(yīng)完畢后，用熒光檢測系統(tǒng)記錄微流控芯片上每個微系統(tǒng)的擴(kuò)增情況，最后以泊松分布模型來計算初始體系中核酸分子的數(shù)量，可謂是生物分子檢測與統(tǒng)計學(xué)的完美結(jié)合。dPCR已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微生物檢測等領(lǐng)域。

附：可使用到的耐思產(chǎn)品