作者：Linkam Scientific Instruments銷售及市場部經理Clara Ko

在過去的二十年中，冷凍顯微鏡方法已經成為生命科學家、制藥研究人員等廣泛使用的有效工具，用于檢查接近其原生狀態的生物結構1。冷凍顯微鏡能夠可視化蛋白質和蛋白質復合物等物質的生物分子結構，是對現有的方法如x射線晶體學和核磁共振(NMR)等的有價值的補充。確定蛋白質和蛋白質復合物的結構是藥物發現的一個重要部分，這對研究藥物靶點非常有意義，也是深入了解疾病機制的重要課題。

在這篇文章中，我們將闡述冷凍顯微鏡技術的使用，包括冷凍光學電子顯微鏡(cryo-CLEM)，冷凍干燥顯微鏡(FDM)，藥物研究中的低溫保存，以及溫度控制顯微鏡如何使研究人員能夠在低溫下推進藥物發現和開發研究。

冷凍光學電子顯微鏡（Cryo-CLEM）
電子顯微鏡(EM)使用微量材料，具備接近原子的分辨率，可以研究不同功能狀態下的分子。冷凍電鏡（Cryo-EM）使用極低溫度，克服了真空條件下使用電子束測量高含水量生物標本的難題。

在20世紀80年代冷凍電鏡商業化之前，生物標本是通過化學固定或染色等方法制備的，但這些方法存在保存偽影，會影響圖像分辨率。快速冷凍通常用于將樣品保持在與自然生理環境相似的冷凍狀態，在臨床前階段取得的結果必須在臨床研究中可復制，這在藥物研究中尤其重要。 

Cryo-CLEM結合低溫熒光技術和冷凍電鏡技術，提高了活檢細胞內生物、化學和遺傳過程的靈敏度。Cryo-CLEM能夠對冷凍固定樣品中的分子或分子組件(如細胞內膜、DNA或細胞結構元件)進行直接熒光標記和靶向，精確定位區域，以便后續使用EM進行高分辨率成像。

為了使生物樣品與EM中發現的真空條件兼容并保存結構細節，樣品被嵌入玻璃狀的冰中，需要保持在-140°C以下。必須避免與空氣中水分接觸，因為一旦接觸會形成冰晶并污染樣品。在低溫條件下，熒光信號的結構細節被保留，光漂白顯著減少。

冷凍光學電子顯微鏡技術的進步體現在它包含了創新的冷凍熒光級，如Linkam CMS196，它能夠自動獲取整個電鏡網格的高分辨率熒光圖。這也用于樣品導航，并將cryo-CLEM的案例情況與EM或與x射線顯微鏡等其他技術相關聯。

西班牙巴塞羅那的一組研究人員和臨床醫生使用熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)和低溫軟x射線斷層掃描(cryo-SXT)，可以觀察到抗癌藥物順鉑在極低濃度下的有效性，確定產生效果所需的最低劑量，以最大限度地降低毒性2。該小組在熒光顯微鏡上對低溫冷凍的細胞樣本進行成像，使用CMS196冷凍熒光臺在液氮溫度下將它們玻璃化，然后使用cryo-SXT對樣本進行分析，這使得在納米尺度上進行3D研究成為可能。

得益于現有的低溫成像技術，研究結果表明，三甲堿(研究的兩種佐劑之一)促進了順鉑在較低劑量下的有效治療，這可能為化療治療的發展鋪平了道路，減少了對患者的副作用。

凍干顯微鏡
許多藥物生產為凍干或凍干配方，以增加穩定性和延長保質期。藥物開發人員必須為新的藥物化合物創建一個優化的冷凍干燥過程，這可能是一項復雜而昂貴的工作。為了簡化流程和開發更高效的冷凍干燥循環，了解三個主要冷凍干燥步驟的溫度和壓力要求是很重要的。使用冷凍干燥顯微鏡(FDM)，研究人員可以直接可視化每個步驟，并確定藥物產品在不同熱條件下的行為。

FDM包括一個專用的光學顯微鏡和一個專用的熱工作臺，它可以準確地控制樣品的溫度和壓力，并允許實時進行熱測量。冷凍干燥的一個關鍵參數是塌陷溫度(Tc)，即產品失去結構完整性并導致加工缺陷的溫度。FDM使藥物開發人員能夠密切監測樣品并快速有效地調整冷凍干燥方案。

英國國家生物標準與控制研究所(NIBSC)的一個研究小組正在利用先進的FDM技術研究冷凍干燥藥物的復雜性。該小組由Paul Matejtschuk博士領導，正專注于研究優化凍干脂質體藥物的配方。由于凍干脂質體藥物物理和化學性質不穩定，這對開發提出了挑戰。Matejtschuk博士和他的團隊使用安裝在光學顯微鏡上的專用冷凍臺(FDCS196, Linkam科學儀器)(圖1)，通過估計凍結、塌陷和融化溫度，預測脂質體-冷凍保護劑混合物的理想的冷凍干燥條件3。