qPCR實驗過程中的注意事項和問題處理方法

瀏覽次數：4447　發布日期：2023-1-5　來源：MedChemExpress

首先，幫大家區分一下幾個生物實驗中飄來飄去的“象形”詞——PCR、qPCR、逆轉錄/反轉錄……

PCR (Polymerase Chain Reaction)：聚合酶鏈式反應，基于堿基互補配對原則放大擴增特定 DNA 片段的分子生物學技術，即將微量的 DNA 指數增加。

qPCR (Quantitative Real-time PCR)：實時熒光定量 PCR，一般是 real-time PCR 的簡稱。指在 PCR 反應中，通過熒光化學物質檢測 PCR 循環后的產物總量，反應中需通過內參或外參對特定 DNA 進行定量分析。后續可通過擴增曲線 (Amplification curve) 和熔解曲線分析 (Dissociation curve) 定量結果。

逆轉錄或反轉錄 (Reverse transcription)：是指以 RNA 為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成 cDNA 的過程，通常所提及的 RT-PCR 或 RT-qPCR 詞中的 RT 便是此意。后續便可以此 cDNA 為模板進行 PCR 或 qPCR 實驗。

圖 1. 分子生物學的中心法則

RNA-cDNA-qPCR，是做定量的一個常見實驗流程，即先從目標樣本中提取 RNA，通過逆轉錄酶進行逆轉錄得到單鏈 cDNA，并以此為模板進行 qPCR，大都為驗證某個基因的相對表達量，那如何讓這個過程 “絲絲滑滑” 呢？

RNA 的質量很關鍵

若想定量數據好，優質 RNA 可是個寶！RNA 提取時的注意事項就不再 balabala 了，得到 RNA 后，對其質量進行檢測分析那可少不了。嚯嚯，下面這兩方面可得好好 “宣講” 一下。

■ 濃度和純度
RNA 具有連續的吸光譜，其在 260 nm 處具有最高吸收峰；蛋白在 280 nm 處有最大吸收峰；230 nm 處的吸光度可反映乙醇、GTC、GuHCl、EDTA 等的含量。因此，在 RNA 的質檢參數中，260、280 和 230 nm 下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質及有機溶劑等的值。一般情況下，RNA 純度檢測時我們大都只看其在 OD260/OD280 比例中的數值范圍，少量的蛋白、鹽或基因組等污染我們是可以接受的。

(得嘞，RNA，嬌貴嬌貴！包容包容！我懂我懂！)

圖 2. RNA 質量的判斷

■ 完整度評估

mRNA 約占總 RNA 的 3%，rRNA 約占總 RNA 的 80% 以上。一般可通過凝膠電泳對 RNA (主要是 rRNA) 的完整性進行評估。那如何通過 RNA 的膠圖分析這各種污染 “Bug” 呢？

以真核生物舉例：完整的總 RNA 電泳后會產生 28S、18S、5.8S 的 rRNA 條帶，28S 與 18S 的條帶強度大致比例應為 2:1 (圖 3a)。電泳條帶 5.8S rRNA 出現則表示有輕微降解。RNA 本身就 “矯情”，得 “富養”~，因此在一般實驗中，5.8S 條帶出現很正常，但如果只有這一種條帶且有明顯彌散現象 (圖 3b)，后續逆轉錄的話還是建議 “及時止損” 吧！

若在 28S 以上出現多余的條帶，還賊亮，gDNA 污染，無疑了 (圖 3b)！若在點樣孔中還有明亮亮的 “釘子戶”，大概率的蛋白污染，可以“定罪了”。

真核生物膠圖的目的條帶為 23S、16S 和 5S，質檢方法參照以上即可。

(如果你跑的膠明顯的干干凈凈、“不染世俗”，小可憐，RNA 提取，再來一遍吧！)

圖 3. RNA 凝膠電泳圖。
a. 高質量 RNA；b. gDNA 殘留；c. 蛋白殘留；d. RNA 降解。

逆轉錄，這些坑能躲則躲

還是以真核生物舉例：RNA 逆轉錄為 cDNA，看似簡單，實則 “心潮澎湃”，屢戰屢敗的實驗汪們已經小心到呼吸頻率都降低了，但各種問題還是奇奇怪怪，而且跨完 “此坑” 又見 “彼坑”。

冷靜冷靜，你能行！戳一戳，往期逆轉錄避坑指南，你想要的答案都在這里 (→RNA 逆轉錄失敗，達咩！)。

qPCR 十做九“謝”，這些操作你可長點心吧

qPCR 到底有多“詭異”，你且看看這些痛苦科研汪的 “表白橋段”：
“實不相瞞，這 qPCR 的 S 曲線一點都不 S，它的腰去哪了？”——沒了！
“一杯敬實驗，一杯敬文章，看完 qPCR 的結果，我不想談戀愛了。”——單著！
“看完我的 Ct 值，我就知道，不用 △△t 了，再愛已經沒有意義了。”——分手！
“師姐，qPCR 都做好多次了，擴增曲線還是亂七八糟，是不是我不配？”——不配！