植物表型成像技術應用：植物病害表型組學分析（二）
自然界中的植物都會面臨各種病害的侵染。病害防治更是農業生產中的重中之重。科學家們一直致力于用各種技術研究植物病害的發病機制和防治方法。在近年的最新研究中，新興的組學研究技術逐漸成為病害研究的熱點。在各種組學技術中，從直觀、無損、快速、簡便以及農業應用推廣上考慮，植物表型成像分析技術無疑是最優的選擇之一。
傳統表型概念里以形態學指標為主。而現代植物表型成像分析技術已經不局限于形態學，其主要應用的成像技術如下，它們在植物病害研究分別反映植物的不同表型變化與生理過程：
植物病害的病原體有病毒、細菌、真菌。而植物種類又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技術能夠應對這些不同的研究需求嗎？我們從具體的文獻案例里查找答案。上一期我們介紹了抗病毒基因、蔬菜水果的葉片細菌病害相關研究案例，本期則主要介紹蔬菜、水果葉片與根系細菌、真菌病害；水稻細菌病害；病毒病害高通量表型分析等研究案例。
一、蔬菜、水果葉片與根系細菌、真菌病害表型分析
西班牙國家研究委員會（CSIC）綜合利用植物表型成像技術對病害進行的相關研究已經持續了近10年。研究人員利用FluorCam葉綠素熒光成像技術、FluorCam UV-MCF多光譜熒光成像技術、熱成像技術從時間和空間尺度上分別反映病原體感染對光合作用、次級代謝、氣孔導度的影響。研究方向涉及多種細菌、真菌和蔬菜、水果，下面列舉部分研究成果：
細菌性軟腐病菌Dickeya dadantii是農業上的重要病害。這種病菌會先圍繞一個萎黃環出現多個壞死斑點，進而整個感染區域壞死并逐漸擴展到周圍的組織中。研究人員使用這三種技術對甜瓜葉感染Dickeya dadantii進行了成像測量，同時通過機器學習來處理這些成像技術獲得的數據，建立數學算法來分類葉片感染區域，從而快速識別病害的發生。
相同的儀器技術也可用于研究真菌引起的植物葉片病害，比如由真菌Podosphaera fusc感染引起的白粉病。通過對感染白粉病的西葫蘆葉片進行FluorCam UV-MCF多光譜熒光和熱成像分析，發現UV-MCF多光譜熒光參數F520/F680對于識別白粉病特別靈敏。而熱成像與F440成像結果則表明，白粉病對葉片氣孔關閉與次生代謝物合成的影響也是非常顯著的。
CSIC的研究人員還發現可以通過植物表型技術檢測植物的地上部來發現根系的病害。比如被根系寄生雜草列當Orobanche cumana Wallr寄生的向日葵，真菌Rosellinia necatrix引起的牛油果根系白紋羽病等。這些研究為根系病害的前期發現與防治提供了有力的技術支持。
參考文獻：
1.Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164
2.Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology,
3.Ortiz-Bustos C M, et al. 2017. Use of Blue-Green Fluorescence and Thermal Imaging in the Early Detection of Sunflower Infection by the Root Parasitic Weed Orobanche cumana Wallr. Frontiers in Plant Science 8:833
4.Granum E, et al. 2015Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9
二、水稻稻瘟病、白葉枯病與干旱抗性的無損定量檢測
在農業生產實踐中，作物經常會同時面臨生物和非生物脅迫的雙重影響。水稻作為種植面積最廣的作物，從而面臨一系列的環境挑戰。在熱帶和亞熱帶地區，水稻面臨的最主要非生物脅迫就是干旱脅迫，同時如稻瘟病、白葉枯病等病害也會嚴重降低水稻的產量。
捷克科學院全球變化研究所聯合美國堪薩斯州立大學、國際水稻研究所等單位開展了這方面的研究。研究者通過FP100手持式葉綠素熒光儀、FluorCam便攜式熒光成像儀和SpectraPen手持式光譜儀分別測量多種近等基因系水稻在不同脅迫下的葉綠素熒光參數與植被指數，試圖在田間快速識別病害與干旱的發生。
葉綠素熒光分析表明，光系統II最大量子產額Fv/Fm、實際量子產額QY_Lss和穩態葉綠素熒光Ft_Lss都可以有效地分辨稻瘟病和白葉枯病。而在進行干旱脅迫檢測時，QY_Lss則效果不好。
通過光譜儀獲得的植被指數則表明稻瘟病和干旱可以通過可見光波段的反射光譜植被指數來檢測，而白葉枯病可以通過近紅外波段相關的反射光譜植被指數來檢測。
參考文獻：
1.Šebela, et al. 2017. Chlorophyll fluorescence and reflectance-based non-invasive quantification of blast, bacterial blight and drought stresses in rice. Plant and Cell Physiology，59(1):30-43
三、植物病害高通量動態表型成像分析
植物感染病害后的表型改變是一個長期動態變化的過程。理想的表型研究當然是能對這一過程進行連續不斷的監測。但如果用人工測量的方法太過費時費力，這就需要一種能夠兼具植物表型成像分析、植物培養、自動傳送的自動化系統。
赫爾辛基大學國家植物表型研究設施（National Plant Phenotyping Infrastructure，NaPPI）先后裝備了2套PlantScreen高通量自動化植物表型成像分析系統：一套適用于50cm以下的小型植株，如擬南芥或作物幼苗等；一套適用于120cm以下的大型植株，如小麥、玉米等。
赫爾辛基大學的研究人員利用PlantScreen系統研究了甘薯被羽毛斑駁病毒（SPFMV）和褪綠矮化病毒（SPCSV）感染后的表型動態變化。通過連續29天的RGB形態成像、葉綠素熒光成像與紅外熱成像分析，綜合評估了兩種病毒對甘薯造成損傷的嚴重程度。而在病害損傷評估中最靈敏的參數是實際光化學效率ΦPSII和光化學淬滅系數qP。而表型數據的變化又與病毒的分布與積累有明確的相關性。
參考文獻：
1.Wang L, Poque S, Valkonen JPT. 2019. Phenotyping viral infection in sweetpotato using a high-throughput chlorophyll fluorescence and thermal imaging platform. Plant Methods, 15, 116
北京易科泰生態技術公司提供植物病害表型全面技術方案：
1.FluorCam葉綠素熒光/多光譜熒光技術
2.PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺
3.FluorPen手持式葉綠素熒光儀、SpectraPen手持式植物高光譜儀
4.PhenoPlot®輕便型植物表型成像分析系統
5.PhenoPlot®懸浮雙軌式表型成像分析系統
6.PhenoTron®-HSI多功能高光譜成像分析系統
7.PhenoTron®復式智能LED光源培養與光譜成像分析平臺
8.PhenoTron®PTS植物光譜成像分析平臺
9.PhenoTron®-XYZ表型成像分析系統
| 技術類別 | 表型與生理過程 | 病害研究用途 | 常用參數指標 |
| 葉綠素熒光成像技術 | 植物光合能力、光合電子傳遞鏈、光系統熱耗散等光合生理過程 | 評估病害對光合系統損傷程度與機制；由于光系統對脅迫的敏感性，是病害早期預警的最靈敏且最常用技術之一 | 最大光化學效率Fv/Fm、實際光化學效率QY、非光化學淬滅系數NPQ、熒光衰減率“活力指數”Rfd等 |
| UV-MCF紫外激發多光譜熒光成像技術 | 植物在病斑及周邊區域合成大量黃酮、多酚類次生代謝物，以防御病害的擴散 | 通過測量次生代謝物熒光，評估病害的發生程度與植物防御機制的激活 | 次生代謝物熒光F440、F520；葉綠素熒光F690、F740 |
| 形態成像分析技術 | 株高、株寬、葉面積、生物量、生長動態、色彩變化等形態的影響 | 評估不同條件下對植物形態的影響乃至增產效應 | 株高、葉面積及病斑面積、數字生物量等 |
| 多/高光譜（反射光譜）成像分析技術 | 通過反射光譜的變化定量反映植物活力、色素組成、光合作用、生化組成、氮素營養、水分含量等表型生理，對病害的影響進行間接測量。 | 病害對從健康程度、色素組成、營養狀況等方面的影響，同時也配合葉綠素熒光成像技術對病害抗性進行進一步驗證。 | 歸一化植被指數NDVI、光化學反射指數PRI、花青素反射指數ARI、胡蘿卜素反射指數CRI等 |
| 紅外熱成像技術 | 獲得植物表面溫度分布圖及溫度數據 | 通過葉片溫度反映由于病害導致的葉片氣孔導度變化、代謝紊亂等 | 平均溫度、溫度范圍、水脅迫指數I |
植物病害的病原體有病毒、細菌、真菌。而植物種類又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技術能夠應對這些不同的研究需求嗎？我們從具體的文獻案例里查找答案。上一期我們介紹了抗病毒基因、蔬菜水果的葉片細菌病害相關研究案例，本期則主要介紹蔬菜、水果葉片與根系細菌、真菌病害；水稻細菌病害；病毒病害高通量表型分析等研究案例。
一、蔬菜、水果葉片與根系細菌、真菌病害表型分析
西班牙國家研究委員會（CSIC）綜合利用植物表型成像技術對病害進行的相關研究已經持續了近10年。研究人員利用FluorCam葉綠素熒光成像技術、FluorCam UV-MCF多光譜熒光成像技術、熱成像技術從時間和空間尺度上分別反映病原體感染對光合作用、次級代謝、氣孔導度的影響。研究方向涉及多種細菌、真菌和蔬菜、水果，下面列舉部分研究成果：
細菌性軟腐病菌Dickeya dadantii是農業上的重要病害。這種病菌會先圍繞一個萎黃環出現多個壞死斑點，進而整個感染區域壞死并逐漸擴展到周圍的組織中。研究人員使用這三種技術對甜瓜葉感染Dickeya dadantii進行了成像測量，同時通過機器學習來處理這些成像技術獲得的數據，建立數學算法來分類葉片感染區域，從而快速識別病害的發生。
參考文獻：
1.Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164
2.Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology,
3.Ortiz-Bustos C M, et al. 2017. Use of Blue-Green Fluorescence and Thermal Imaging in the Early Detection of Sunflower Infection by the Root Parasitic Weed Orobanche cumana Wallr. Frontiers in Plant Science 8:833
4.Granum E, et al. 2015Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9
二、水稻稻瘟病、白葉枯病與干旱抗性的無損定量檢測
在農業生產實踐中，作物經常會同時面臨生物和非生物脅迫的雙重影響。水稻作為種植面積最廣的作物，從而面臨一系列的環境挑戰。在熱帶和亞熱帶地區，水稻面臨的最主要非生物脅迫就是干旱脅迫，同時如稻瘟病、白葉枯病等病害也會嚴重降低水稻的產量。
捷克科學院全球變化研究所聯合美國堪薩斯州立大學、國際水稻研究所等單位開展了這方面的研究。研究者通過FP100手持式葉綠素熒光儀、FluorCam便攜式熒光成像儀和SpectraPen手持式光譜儀分別測量多種近等基因系水稻在不同脅迫下的葉綠素熒光參數與植被指數，試圖在田間快速識別病害與干旱的發生。
葉綠素熒光分析表明，光系統II最大量子產額Fv/Fm、實際量子產額QY_Lss和穩態葉綠素熒光Ft_Lss都可以有效地分辨稻瘟病和白葉枯病。而在進行干旱脅迫檢測時，QY_Lss則效果不好。
| 植被指數 | 公式 | 相關性 |
| 反射比RR | R550/R675 | 稻瘟病 |
| 反射比RR | R570/R675 | 稻瘟病 |
| 反射比RR | R675/R700 | 葉綠素a |
| 反射比RR | R672/R550 | 葉綠素b |
| 反射比RR | R750/R550 | 總葉綠素 |
| 結構反射指數SRI | R750/R700 | 總葉綠素 |
| 歸一化植被指數NDVI | (R755+R664)/(R755-R664) | 總葉綠素 |
| 反射比RR | (R780-R710)/(R780-R680) | 總葉綠素 |
| 歸一化光譜指數NDSI | (R550-R410)/(R550+R410) | 葉綠素b |
| 光化學反射指數PRI | (R531-R570)/(R531+R570) | 光合作用 |
| 類胡蘿卜素反射指數CRI700 | 1/R510-1/R700 | 總類胡蘿卜素 |
研究中使用的反射光譜植被指數
參考文獻：
1.Šebela, et al. 2017. Chlorophyll fluorescence and reflectance-based non-invasive quantification of blast, bacterial blight and drought stresses in rice. Plant and Cell Physiology，59(1):30-43
三、植物病害高通量動態表型成像分析
植物感染病害后的表型改變是一個長期動態變化的過程。理想的表型研究當然是能對這一過程進行連續不斷的監測。但如果用人工測量的方法太過費時費力，這就需要一種能夠兼具植物表型成像分析、植物培養、自動傳送的自動化系統。
赫爾辛基大學國家植物表型研究設施（National Plant Phenotyping Infrastructure，NaPPI）先后裝備了2套PlantScreen高通量自動化植物表型成像分析系統：一套適用于50cm以下的小型植株，如擬南芥或作物幼苗等；一套適用于120cm以下的大型植株，如小麥、玉米等。
1.Wang L, Poque S, Valkonen JPT. 2019. Phenotyping viral infection in sweetpotato using a high-throughput chlorophyll fluorescence and thermal imaging platform. Plant Methods, 15, 116
北京易科泰生態技術公司提供植物病害表型全面技術方案：
1.FluorCam葉綠素熒光/多光譜熒光技術
2.PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺
3.FluorPen手持式葉綠素熒光儀、SpectraPen手持式植物高光譜儀
4.PhenoPlot®輕便型植物表型成像分析系統
5.PhenoPlot®懸浮雙軌式表型成像分析系統
6.PhenoTron®-HSI多功能高光譜成像分析系統
7.PhenoTron®復式智能LED光源培養與光譜成像分析平臺
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