三種常用化學消毒劑對諾卡菌屬的消毒效果實驗對比
實驗目的：通過常用化學消毒劑對諾卡菌屬的消毒效果，為諾卡菌屬的消毒策略提供依據(jù)。
實驗方法： 以鼻疽諾卡菌為指示菌，分別選取高效消毒劑（含氯類）、中效消毒劑（醇類）、中低效消毒劑（季銨鹽類）進行載體浸泡定量殺菌試驗，并以染有定量鼻疽諾卡菌的不銹鋼臺面為對象進行物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗。結果 載體浸泡定量殺菌試驗結果表明，60%乙醇作用2min、有效氯500mg/L 含氯消毒劑作用 5min、1000mg/L季銨鹽作用10min均可完全殺滅鼻疽諾卡菌物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，75%乙醇作用5min，有效氯1000mg/L含氯消毒劑作用 10 min 均對鼻疽諾卡菌有完全殺滅效果，而1900mg/L季銨鹽作用20min仍未能完全殺滅鼻疽諾卡菌。
實驗結論 ：針對諾卡菌屬選用常用化學消毒劑時，可初選醇類和含氯消毒劑；若選用季銨鹽類消毒劑，則需較高的濃度和較長的作用時間。
具體實驗步驟：
1. 菌懸液的制備
參照2002年版《消毒技術規(guī)范》的方法，取鼻疽諾卡菌48 h新鮮培養(yǎng)物，用胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)洗脫，加入有機干擾物牛血清白蛋白，菌懸液濃度為2.5×107～2.5×108 cfu/mL
2. 消毒劑選擇及配制
在實驗室常用消毒劑中，分別選取高效消毒劑(84消毒液)、中效消毒劑。(75%乙醇)和中低效消毒劑(雙癸基二甲基溴化銨)。用無菌標準硬水配制成使用濃度。
3.中和劑鑒定試驗
中和劑為D/E中和肉湯主要中和成分為0.1%硫乙醇酸鈉、0.6%硫代硫酸鈉、0.25%亞硫酸氫鈉、0.7%卵磷脂和0.5%吐溫80。按2002年版《消毒技術規(guī)范》)對上述消毒劑進行中和劑鑒定試驗。
4.載體浸泡定量殺菌試驗
以不銹鋼圓片為載體，對鼻疽諾卡菌進行載體浸泡定量殺菌試驗。
5.對比實驗：
根據(jù)各類消毒劑的特性分別設定3組作用時間，以該消毒劑的常用濃度為起始濃度，若全殺滅則降低濃度繼續(xù)試驗，直至達到該消毒劑的min使用濃度，對照組回收菌量為5×105~5×106cfu/片，殺滅對數(shù)值≥3.00判定為消毒合格。
6.物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗
統(tǒng)一使用 500 mL噴壺，以染有定量鼻疽諾卡菌的不銹鋼試驗臺面為對象，用各消毒劑的常用濃度進行定量噴灑消毒。對照組回收菌量為5×105~5×106cfu/cm2,殺滅對數(shù)值≥3.00判定為消毒合格。
7.載體浸泡定量殺菌試驗結果
3組消毒劑以常用濃度75%乙醇作用1 min、有效氯1000 mg/L含氯消毒劑作用2 min、1900 mg/L 季銨鹽作用5 min均能完全殺滅鼻疽諾卡菌(表1)。3組消毒劑降低濃度，60%乙醇作用2 min、有效氯500 mg/L含氯消毒劑作用5 min、1000 mg/L,季銨鹽作用10 min均可完全殺滅鼻疽諾卡菌。
8.物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗結果
3組消毒劑以常用濃度作用，即75%乙醇作用5 min、1000 mg/L有效氯作用5 min可全殺滅諾卡菌；而1900 mg/L季銨鹽作用20 min仍未完全殺滅諾卡菌，但殺滅對數(shù)值達到4.45,可判為消毒合格(表3)。
常用化學消毒劑消毒機理：
諾卡菌屬細胞壁的結構組成與革蘭陽性菌相似，其主要成分為肽聚糖，N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁借助β-1，4糖苷鍵連接成鏈狀結構，再由胞壁酸上的短肽側鏈進一步交聯(lián)成為立體網(wǎng)格分子，增強細胞壁的保護效果 ，防止多種殺菌藥液滲入，理論上會導致對化學消毒劑的抵抗力較強，消毒難度增大。
乙醇廣泛用于皮膚黏膜以及醫(yī)療器械和精密儀器表面消毒，消毒機制是對微生物的脫水作用，以及蛋白質變性、凝固，破壞細胞壁和細胞膜的結構功能，同時能夠破壞微生物酶系統(tǒng)，阻礙其正常代謝83。對于放線菌來說，主要消毒方法的報道是土壤中物理 或農(nóng)藥的殺滅試驗，關于乙醇對其消毒效果的觀察未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，載體浸泡定量殺菌試驗中，75%的乙醇作用1 min對諾卡菌屬具有較好殺滅效果浸泡60%的乙醇消毒劑殺滅諾卡菌屬也僅需作用2min。這說明較低濃度的乙醇仍然能有效殺滅諾卡菌屬，或對乙醇為主要殺菌成分或復配成分的消毒劑生產(chǎn)有指導意義。
含氯消毒劑溶于水能產(chǎn)生次氯酸，破壞微生物細胞壁，繼而進入細胞內，氧化破壞細胞成分，使其代謝失調、停止。在酸性環(huán)境中含氯消毒劑溶解過程能產(chǎn)生更多的次氯酸，從而使其殺菌能力增強。同時，氯能與細胞中代謝相關的酶形成氮-氧化合物，使細胞產(chǎn)生代謝障礙而死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，使用500mg/L 含氯消毒劑擦拭重癥醫(yī)學科物體表面，對多種耐藥菌和耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有殺滅效果。
載體浸泡定量殺菌試驗結果顯示，500mg/L有效氯作用2、5、10min對鼻疽諾卡菌均有殺滅效果物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，有效氯500mg/L含氯消毒劑作用5min、有效氯1000mg/L含氯消毒劑作用2min 即有殺滅效果，提示隨消毒劑內有效氯濃度增加和作用時間延長，殺滅效果也隨之提高。
季銨鹽類化合物是一類陽離子表面活性劑，包括單鏈季銨鹽和雙鏈季銨鹽，其殺菌作用機制主要是帶正電荷的陽離子通過異性電荷的吸引作用，在菌體表面濃集，再滲透擴散穿透細胞壁使其被破壞，經(jīng)過被破壞的細胞膜人侵到細胞內部，使蛋白質變性沉淀，酶活性受到損害，加速細菌調亡季銨鹽是近些年在消毒領域應用廣泛的新型消毒劑，對細菌、真菌和親脂病毒均有良好的殺滅效果。
季銨鹽載體消毒濕巾對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、泛耐藥鮑曼不動桿菌及泛耐藥銅綠假單胞菌均有較好的殺滅效果。
另外，季銨鹽類消毒劑有一定持效殺菌作用，單鏈季銨鹽、復合季銨鹽和固化季銨鹽，其殺菌持效性依次增強；同樣，雙鏈季銨鹽消毒劑在較低濃度下（850mg/L）對表面噴霧后存放4h后，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌仍具有良好的持效殺滅作用；
雙鏈季銨鹽消毒液（含量0.3%±0.03%）對ICU物品表面的消毒適宜間隔時間為8h，研究結果表明季銨鹽具有持效殺菌作用。
在該實驗中，載體定量殺菌濃度1000 mg/L季銨鹽，作用10min可全殺滅諾卡菌；物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，1900mg/L季銨鹽才能達到殺滅效果，說明日常消毒過程中可使用較高濃度的季銨鹽并延長作用時間。
來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
實驗方法： 以鼻疽諾卡菌為指示菌，分別選取高效消毒劑（含氯類）、中效消毒劑（醇類）、中低效消毒劑（季銨鹽類）進行載體浸泡定量殺菌試驗，并以染有定量鼻疽諾卡菌的不銹鋼臺面為對象進行物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗。結果 載體浸泡定量殺菌試驗結果表明，60%乙醇作用2min、有效氯500mg/L 含氯消毒劑作用 5min、1000mg/L季銨鹽作用10min均可完全殺滅鼻疽諾卡菌物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，75%乙醇作用5min，有效氯1000mg/L含氯消毒劑作用 10 min 均對鼻疽諾卡菌有完全殺滅效果，而1900mg/L季銨鹽作用20min仍未能完全殺滅鼻疽諾卡菌。
實驗結論 ：針對諾卡菌屬選用常用化學消毒劑時，可初選醇類和含氯消毒劑；若選用季銨鹽類消毒劑，則需較高的濃度和較長的作用時間。
具體實驗步驟：
1. 菌懸液的制備
參照2002年版《消毒技術規(guī)范》的方法，取鼻疽諾卡菌48 h新鮮培養(yǎng)物，用胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)洗脫，加入有機干擾物牛血清白蛋白，菌懸液濃度為2.5×107～2.5×108 cfu/mL
2. 消毒劑選擇及配制
在實驗室常用消毒劑中，分別選取高效消毒劑(84消毒液)、中效消毒劑。(75%乙醇)和中低效消毒劑(雙癸基二甲基溴化銨)。用無菌標準硬水配制成使用濃度。
3.中和劑鑒定試驗
中和劑為D/E中和肉湯主要中和成分為0.1%硫乙醇酸鈉、0.6%硫代硫酸鈉、0.25%亞硫酸氫鈉、0.7%卵磷脂和0.5%吐溫80。按2002年版《消毒技術規(guī)范》)對上述消毒劑進行中和劑鑒定試驗。
4.載體浸泡定量殺菌試驗
以不銹鋼圓片為載體，對鼻疽諾卡菌進行載體浸泡定量殺菌試驗。
5.對比實驗：
根據(jù)各類消毒劑的特性分別設定3組作用時間，以該消毒劑的常用濃度為起始濃度，若全殺滅則降低濃度繼續(xù)試驗，直至達到該消毒劑的min使用濃度，對照組回收菌量為5×105~5×106cfu/片，殺滅對數(shù)值≥3.00判定為消毒合格。
6.物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗
統(tǒng)一使用 500 mL噴壺，以染有定量鼻疽諾卡菌的不銹鋼試驗臺面為對象，用各消毒劑的常用濃度進行定量噴灑消毒。對照組回收菌量為5×105~5×106cfu/cm2,殺滅對數(shù)值≥3.00判定為消毒合格。
7.載體浸泡定量殺菌試驗結果
3組消毒劑以常用濃度75%乙醇作用1 min、有效氯1000 mg/L含氯消毒劑作用2 min、1900 mg/L 季銨鹽作用5 min均能完全殺滅鼻疽諾卡菌(表1)。3組消毒劑降低濃度，60%乙醇作用2 min、有效氯500 mg/L含氯消毒劑作用5 min、1000 mg/L,季銨鹽作用10 min均可完全殺滅鼻疽諾卡菌。
8.物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗結果
3組消毒劑以常用濃度作用，即75%乙醇作用5 min、1000 mg/L有效氯作用5 min可全殺滅諾卡菌；而1900 mg/L季銨鹽作用20 min仍未完全殺滅諾卡菌，但殺滅對數(shù)值達到4.45,可判為消毒合格(表3)。
常用化學消毒劑消毒機理：
諾卡菌屬細胞壁的結構組成與革蘭陽性菌相似，其主要成分為肽聚糖，N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁借助β-1，4糖苷鍵連接成鏈狀結構，再由胞壁酸上的短肽側鏈進一步交聯(lián)成為立體網(wǎng)格分子，增強細胞壁的保護效果 ，防止多種殺菌藥液滲入，理論上會導致對化學消毒劑的抵抗力較強，消毒難度增大。
乙醇廣泛用于皮膚黏膜以及醫(yī)療器械和精密儀器表面消毒，消毒機制是對微生物的脫水作用，以及蛋白質變性、凝固，破壞細胞壁和細胞膜的結構功能，同時能夠破壞微生物酶系統(tǒng)，阻礙其正常代謝83。對于放線菌來說，主要消毒方法的報道是土壤中物理 或農(nóng)藥的殺滅試驗，關于乙醇對其消毒效果的觀察未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，載體浸泡定量殺菌試驗中，75%的乙醇作用1 min對諾卡菌屬具有較好殺滅效果浸泡60%的乙醇消毒劑殺滅諾卡菌屬也僅需作用2min。這說明較低濃度的乙醇仍然能有效殺滅諾卡菌屬，或對乙醇為主要殺菌成分或復配成分的消毒劑生產(chǎn)有指導意義。
含氯消毒劑溶于水能產(chǎn)生次氯酸，破壞微生物細胞壁，繼而進入細胞內，氧化破壞細胞成分，使其代謝失調、停止。在酸性環(huán)境中含氯消毒劑溶解過程能產(chǎn)生更多的次氯酸，從而使其殺菌能力增強。同時，氯能與細胞中代謝相關的酶形成氮-氧化合物，使細胞產(chǎn)生代謝障礙而死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，使用500mg/L 含氯消毒劑擦拭重癥醫(yī)學科物體表面，對多種耐藥菌和耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌有殺滅效果。
載體浸泡定量殺菌試驗結果顯示，500mg/L有效氯作用2、5、10min對鼻疽諾卡菌均有殺滅效果物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，有效氯500mg/L含氯消毒劑作用5min、有效氯1000mg/L含氯消毒劑作用2min 即有殺滅效果，提示隨消毒劑內有效氯濃度增加和作用時間延長，殺滅效果也隨之提高。
季銨鹽類化合物是一類陽離子表面活性劑，包括單鏈季銨鹽和雙鏈季銨鹽，其殺菌作用機制主要是帶正電荷的陽離子通過異性電荷的吸引作用，在菌體表面濃集，再滲透擴散穿透細胞壁使其被破壞，經(jīng)過被破壞的細胞膜人侵到細胞內部，使蛋白質變性沉淀，酶活性受到損害，加速細菌調亡季銨鹽是近些年在消毒領域應用廣泛的新型消毒劑，對細菌、真菌和親脂病毒均有良好的殺滅效果。
季銨鹽載體消毒濕巾對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、泛耐藥鮑曼不動桿菌及泛耐藥銅綠假單胞菌均有較好的殺滅效果。
另外，季銨鹽類消毒劑有一定持效殺菌作用，單鏈季銨鹽、復合季銨鹽和固化季銨鹽，其殺菌持效性依次增強；同樣，雙鏈季銨鹽消毒劑在較低濃度下（850mg/L）對表面噴霧后存放4h后，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌仍具有良好的持效殺滅作用；
雙鏈季銨鹽消毒液（含量0.3%±0.03%）對ICU物品表面的消毒適宜間隔時間為8h，研究結果表明季銨鹽具有持效殺菌作用。
在該實驗中，載體定量殺菌濃度1000 mg/L季銨鹽，作用10min可全殺滅諾卡菌；物體表面消毒模擬現(xiàn)場試驗中，1900mg/L季銨鹽才能達到殺滅效果，說明日常消毒過程中可使用較高濃度的季銨鹽并延長作用時間。
來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
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