骨質疏松癥是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨髓間隙中的骨形成減少，導致骨量丟失和微觀結構退變。據估計，骨質疏松癥每年導致全球超過900萬例骨折。因此，迫切需要替代骨質疏松癥的治療方法，特別是能夠抵消骨量流失的療法，這對于老年人群至關重要。
 

人骨髓來源的間充質干細胞（hMSCs）由于其多能性，是骨組織工程和再生醫學的細胞療法的理想選擇。在機械或化學刺激下，可以誘導hMSCs分化為各種譜系，包括成骨細胞、神經母細胞、成脂肪細胞、成肌細胞和成軟骨細胞。此外，hMSCs的分化受到局部機械和化學環境的密切控制，從而在成骨分化和脂肪分化之間保持平衡。成骨分化減少和脂肪分化增加可能導致骨質疏松癥。研究已經鑒定出許多化學刺激（例如，小的生物活性分子，生長因子和遺傳調節因子）來調節hMSCs譜系，包括骨形態發生蛋白（BMP），Wnt和Notch信號。
 

成骨分化是一個動態過程，涉及幾種重要的信號通路，包括YAP / TAZ（具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子），Notch和RhoA信號通路。研究表明，流體剪切力調節間充質干細胞（MSCs）的體外成骨分化。盡管目前的研究表明剪切應力可以增強成骨分化，但由于缺乏有效的工具來檢測和監測活細胞中的基因表達，Notch信號在剪切應力誘導的成骨中的參與尚不清楚。
 

在美國紐黑文大學生物醫學工程系、利哈伊大學生物工程系、杜克大學生物醫學工程系、康涅狄格大學生物醫學工程系的一項聯合研究中，利用雙鏈鎖核酸/DNA（LNA/DNA）納米生物傳感器闡明了Notch信號在暴露于生理相關剪切應力（3-7 dynes/cm2）的hMSCs的成骨分化過程中的調節作用，研究結果將為剪切應力下hMSCs的成骨分化和Notch信號的參與提供新的信息。
 

流體剪切應力調節人骨髓來源的間充質干細胞的增殖和活力

為了研究不同水平的剪切應力對細胞增殖和活力的影響，設計并比較了3組實驗：靜態組，6 h剪切力刺激組和不間斷剪切力刺激組。實驗研究了兩種不同水平的剪切應力：低流體剪切應力（1–9 dynes/cm2）和高流體剪切應力（9–20 dynes/cm2），分別在第3天和5天后評估細胞活力和增殖。
 

圖1 A顯示了不同組別下hMSCs在剪切應力下5 d后的熒光圖像。當hMSCs暴露于連續剪切力5天時，死細胞的數量增加。實驗進一步量化了剪切應力對細胞活力和增殖的影響。施用剪切3 d后，剪切應力下hMSCs的細胞活力和增殖與靜態條件下的hMSCs相比沒有顯著差異（圖1 B、C 左）。5 天后，連續剪切應力下的 hMSCs 細胞活力和增殖顯著降低，與靜態條件下的細胞相比，細胞活力降低 21.5%，增殖減少19.8%（圖1 B、C 右）。此外，在每天6 h施加剪切應力5天后，hMSCs的細胞活力和增殖與靜態狀態的hMSCs相比沒有顯著差異。
 

此外，還研究了高流體剪切應力（9-20 dynes/cm2）對hMSCs的活力和增殖的影響。暴露于高剪切應力3天的hMSCs，不間斷剪切應力組的細胞活力降低了55%。5 d后，6 h刺激組和不間斷刺激組的死細胞數量均顯著增加。此外，與靜態的hMSCs相比，細胞活力分別降低了14.8%和19.2%。高流體剪切應力對細胞增殖的影響具有類似的影響。
 

這些結果表明，剪切應力調節細胞增殖和活力與時間和速度有關。在高流體剪切應力下，細胞活力和增殖降低。在低流體剪切應力下，當細胞暴露于周期性剪切（6h 剪切/天）而不是連續剪切（不間斷剪切）時，其活力和增殖不受影響。總之，對于低流體剪切應力下的hMSCs，每天6小時，持續5天，與靜態條件相比，細胞活力和增殖沒有顯著差異。因此，接下來的實驗選擇了3-7 dynes/cm2，以避免剪切應力對其余研究的細胞活力和增殖的影響。

圖1   剪切應力對細胞活力和增殖的影響。

低流體剪切應力調節人骨髓來源的間充質干細胞的形態

為了研究低流體剪切應力對hMSCs形態的影響，實驗量化并比較了細胞表型行為，包括在有（3-7 dyne/cm2，6h）和沒有剪切應力下的細胞面積，細胞長度，細胞長寬比以及細胞周長。

圖2 A、B顯示了hMSCs在靜態條件下（圖2 A）和暴露于剪切應力下（圖2 B）的熒光圖像。3天后，與靜態條件下培養的hMSCs相比，在剪切應力下培養的hMSCs的細胞面積、長寬比、周長和細胞長度略有增加（細胞面積增加16.3%，細胞長寬比增加14.9%，周長增加18%，細胞長度增加12%）。然而，與在靜態條件下培養的hMSCs相比，暴露于低流體剪切應力5天的hMSCs分別顯示出細胞面積增加55%，細胞長度增加72%，細胞長寬比增加16%和細胞周長增加30%（圖2 C、D）。這些結果表明，hMSCs對低流體剪切應力敏感，形態變化顯著。

圖2   剪切應力對hMSCs形態變化的影響。

低流體剪切應力促進成骨分化

通過施加剪切力（3-7 dyne/cm2），進一步闡明了低流體剪切應力對成骨分化的影響，在成骨誘導和剪切刺激5天后，通過測量ALP酶活性來評估和比較成骨分化，ALP酶活性是早期成骨分化的可靠生化標志物。

圖3 A、B分別顯示了靜態和剪切應力下hMSCs的熒光圖像。在剪切應力下，當誘導hMSCs進行成骨分化時，肌動蛋白細胞骨架發生顯著改變。結果表明，在沒有成骨誘導的情況下，綠色熒光信號最小，表明ALP酶活性最小。隨著成骨誘導，在靜態和剪切應力下，hMSCs的ALP酶活性顯著提高。在靜態條件下，在成骨誘導培養基中培養的hMSCs的ALP活性比在基礎培養基中培養的hMSCs提高了1.8倍。在低流體剪切應力下，ALP活性提高了2.1倍。此外，與靜態條件相比，暴露于剪切應力的hMSCs在成骨誘導后ALP活性增加了15%（圖3 C）。此外，在低流體剪切應力下，hMSCs分化率提高到45.51%，而靜態條件下hMSCs分化率為38.02%（圖3 D）。這些結果表明，低流體剪切應力顯著增強了成骨分化，ALP酶活性和成骨分化率增加。

圖3   剪切應力增強hMSCs成骨分化。

Notch信號參與剪切應力誘導的成骨分化

先前的研究表明，Notch信號參與hMSCs成骨分化過程，介導的ALP活性以及成骨分化率。然而，低流體剪切應力是否通過Notch信號調節hMSCs的成骨分化尚不清楚。為了更好地了解Notch信號在成骨分化過程中的參與，利用藥物DAPT（Notch信號抑制劑）來擾亂Notch信號傳導。hMSCs在有或沒有剪切應力下的成骨分化過程中用濃度為20 μM的DAPT處理，以觀察潛在的相關影響。
 

圖4 A、B顯示了hMSCs在靜態條件和剪切應力下在基礎培養基，誘導培養基和加DAPT處理的誘導培養基中培養的代表性圖像。結果表明，使用DAPT抑制Notch信號在靜態條件和剪切應力下介導了成骨分化。特別是在靜態條件下，隨著DAPT的處理，成骨誘導5 d后的ALP酶活性降低了28.8%。同時，暴露于低流體剪切應力的hMSCs，誘導5 d后的ALP酶活性在DAPT處理下降低了18.2%。有趣的是，剪切應力下hMSCs的DAPT處理對成骨分化的影響較小，表明低流體剪切應力挽救了藥物處理引起的Notch信號傳導的抑制作用。
 

為了進一步研究在低流體剪切應力下成骨分化過程中Notch信號傳導的機制，實驗利用LNA/DNA納米生物傳感器在基礎培養基，誘導培養基和DAPT處理的誘導培養基中檢查了靜態和剪切力條件下的Notch 1配體，Dll4 mRNA的表達。圖4 A、B顯示了不同處理下靜態和剪應力下hMSCs的代表性圖像。在靜態條件下，用成骨誘導培養基培養的hMSCs顯示出Dll4 mRNA的表達顯著增加。DAPT處理后，與成骨誘導組相比，Dll4 mRNA顯著降低（圖4 D）。當暴露于低流體剪切應力時，成骨誘導組hMSCs的Dll4 mRNA表達比在基礎培養基中培養的hMSCs增加了2.72倍。DAPT的處理抑制成骨分化約50%（圖4 D）。與靜態相比，在成骨誘導培養基中培養hMSCs時，Dll4 mRNA表達提高了22.8%。DAPT處理介導剪切應力對成骨分化的影響，Dll4 mRNA表達僅增加約16%。
 

這些結果證明，Notch信號參與并調節了低流體剪切應力下hMSCs的成骨分化。低流體剪切應力上調成骨誘導下hMSCs的Dll4 mRNA表達，表明Notch信號參與機械調節的成骨分化。Notch信號的抑制介導了剪切應力誘導的成骨分化的影響，ALP酶活性降低，Dll4 mRNA表達降低。

圖4   Notch信號在有和無剪切應力情況下調節hMSCs的成骨分化。

在這項研究中，利用LNA/DNA納米生物傳感器在暴露于生理相關的低流體剪切應力的hMSCs的成骨分化過程中檢測Dll4 mRNA基因表達譜。研究結果證明，Notch信號調節剪切應力誘導的成骨分化，表明Notch信號在成骨分化中的機械敏感性作用。進一步的研究可能闡明Notch信號在調節干細胞分化中的機械敏感作用的機制。

參考文獻：Zhao Y, Richardson K, Yang R, Bousraou Z, Lee YK, Fasciano S, Wang S. Notch signaling and fluid shear stress in regulating osteogenic differentiation. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Oct 5;10:1007430. doi: 10.3389/fbioe.2022.1007430. PMID: 36277376; PMCID: PMC9581166.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36277376/

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