腦惡性腫瘤又常稱為腦癌，分原發性和繼發性兩大類：原發性腦惡性腫瘤以腦膠質瘤最多，是一種起源于腦神經膠質細胞的腫瘤；繼發性腫瘤主要是指其他部位的腫瘤轉移到腦內形成的腦轉移性腫瘤，其發病率約是原發腫瘤的10倍，肺癌就是常見的原發癌種之一。
 

2022年11月6日，復旦大學腫瘤醫院金偉教授和曹依群教授團隊在Clin. Transl. Med（IF=8.554）上發表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases”的文章，通過scRNA-seq技術（BD Rhapsody system）聯合多重熒光免疫組化（abs50015，Absin），解析了GM和LC細胞的異質性，發現了一組具有特異性分子標記的干細胞樣細胞，對于肺癌腦轉移的免疫療法有重要的指導性意義。
 

取樣、測序、分析和組織原位驗證的全流程
 

研究中，科學家們發現一部分增殖巨噬細胞簇與不良預后相關。氣泡圖顯示了中樞神經系統駐留小膠質細胞（CNS）以及單核細胞來源的巨噬細胞（MDMs）表達TAMs相關基因的情況，其中CD163在MDMs高表達，而在CNS顯著低表達。通過小提琴圖分析可得，TOP2A基因在增殖巨噬細胞的分布（后兩列），極端值和中位值都比其他細胞更好。后續研究團隊通過對TOP2A和CD163進行多重免疫熒光染色在組織蛋白層面驗證了細胞群。
 

癌癥干細胞（CSCs）是會導致癌癥轉移和化療或放療耐藥性的細胞亞群。研究團隊通過拷貝數變異分析鑒定了惡性細胞并劃分為10個惡性上皮細胞亞群，基于CytoTRACE分析和擬時序分析顯示，惡性上皮細胞亞群中Mep_C3和C8分化程度較低，可能包含CSCs。為了證實Mep_C3和_C8在LC組織中的存在，團隊通過多重免疫組化檢測了主要標記物的表達（EPCAM/DKK1/TRIM29），發現DKK1和TRIM29在這些細胞中特異性富集。
 

總的來說，團隊的研究結果為小膠質細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、ECs和T細胞的特征提供了特別的見解，還發現了癌癥干細胞的一個子集，這將加深對大腦腫瘤微環境的理解，從而為精準醫療的患者管理提供一些改善思路。

多色即多重熒光免疫組化（mIHC），主要原理來自TSA技術，TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。該技術可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統熒光染料和比色檢測系統相兼容。
 

TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價鍵結合位點)，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團結合，經幾次這樣的循環放大，可以結合大量的酶分子or熒光基團，結果使其檢測信號得到幾何級放大。
 

簡單來說，用這種方法做多重熒光染色是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯熒光素），來催化后續添加入體系的非活性熒光素。該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后進行微波處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。

TSA多重熒光免疫組化染色示意圖