小鼠脊柱淋巴和血管網絡的三維可視化

瀏覽次數：1113　發布日期：2022-12-13　來源：锘海生命科學

隨著生物醫學的快速發展，越來越多的科學研究和臨床應用，對生物組織高分辨率三維成像提出了新的需求，比如腫瘤微環境、神經投射、脈管系統等生命科學的研究，都需要生物組織完整的三維結構信息。由于生物組織不透明，傳統對生物組織三維成像的方法，依賴于組織切片的方式來完成，但是這種方式操作繁瑣，且成像通量低。因此，基于機械切片的技術方式越來越不能滿足當下的研究現狀，隨著組織透明化技術和光片顯微成像的結合，正式打開了三維結構可視化研究的大門。

案例分享：
以往研究脊柱淋巴網絡的信息很少，因為這些精細的結構嵌入在椎體組織中，很難用傳統的組織學觀察。2019年發表在Nature communications一篇題為“Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice”的文章成功探究了小鼠脊柱淋巴網絡的結構與功能。在文章中，作者首先通過對脊柱節段采用iDISCO+方法進行免疫染色及透明化，結合一定的脫鈣處理，并利用光片熒光顯微鏡進行成像，發現脊柱椎管內有廣泛而復雜的淋巴管系統。

原文Fig.2經PROX1抗體染色的透明化胸椎，展示脊柱淋巴管系統的模塊化結構。

原文Fig.8 采用LYVE1（綠色）和CD45（紫色）抗體對透明化后的頸椎節段進行雙標記，表明脊髓淋巴管與免疫細胞的相互作用。

原文Fig.S1透明化胸椎的淋巴和血管系統。a、b透明化的胸椎節段進行PROX1（白色）/LYVE1（紅色）雙染色以識別淋巴管。c-h用LYVE1（綠色）和Podocalyxin（紫色）雙標記以識別血管。
總之，組織透明化及3D成像技術可通過保留脊柱解剖結構和脈管系統三維連續性來描述淋巴、血管系統。

透明化染色方法流程：
文章使用了Renier及其同事開發的一種透明化方案，該方案基于甲醇脫水，并稱為對溶劑透明化的器官進行免疫標記的三維成像（iDISCO+， http://www.idisco.info ）。梯度增加的甲醇濃度會導致適度的組織收縮（約10%），以及組織的“透明度”增加：

經過固定的樣品分別在20、40、60、80、100% 甲醇/PBS中逐步脫水1h。
然后將其在33%甲醇/66%二氯甲烷（DCM）的溶液中孵育過夜。
用100%甲醇洗滌2 × 1 h后，樣品用5% H₂O₂甲醇（1 vol 30% H₂O₂/5 vol甲醇）在4℃漂白過夜。
漂白后，樣品分別在80、60、40、20%甲醇、PBS中再水化1 h。
為了透明化脊柱，文章中添加了一個使用莫爾斯溶液的脫鈣步驟，在室溫下孵育30分鐘。使用莫爾斯溶液（1/1檸檬酸鈉和45%甲酸）的弱酸處理可以有效地對組織脫鈣，同時保留其結構。
用PBS快速洗滌樣品，然后在PTx2 （PBS/0.2% Triton X-100）中孵育2 × 1 h。在這一步后，對樣本進行免疫染色處理。
樣本在PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中，37℃孵育24 h。
然后在PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%驢血清中，37℃封閉24 h。
樣品在PTwH （PBS/0.2%吐溫-20與10 mg/ml肝素）/5% DMSO/3%驢血清的一抗稀釋液中，37℃孵育6天。
樣本在PTwH中洗滌5次直至次日。
然后在PTwH/3%驢血清二抗體稀釋中，37℃孵育4天。
最后在PTwH中洗滌5次直至次日。
然后將樣本在33%/DCM 66%甲醇溶液中孵育過夜。
隨后在100% DCM中孵育2 × 15 min以洗滌甲醇。
最后，樣品在二芐醚（DBE）中孵育，直到透明化（約4 h），即可成像。

參考文獻：

Jacob L, Boisserand LSB, Geraldo LHM, et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nat Commun. 2019;10(1):4594.

Renier N, et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 2014;159:896–910.

Morse A. Formic acid-sodium citrate decalcification and butyl alcohol dehydration of teeth and bones for sectioning in paraffin. J. Dent. Res. 1945;24:143–153.

Shibata Y, Fujita S, Takahashi H, Yamaguchi A, Koji T. Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues. Histochem. Cell Biol. 2000;113:153–159.

González-Chávez SA, Pacheco-Tena C, Macías-Vázquez CE, Luévano-Flores E. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013;6:1972–1983.

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