期刊名稱：Biomaterials Research

原文標題：Renal clearable bone-targeted contrast agents for theranostic imaging

作者：Haoran Wang，Homan Kang，Kai Bao*，Hak Soo Choi*，et,al.

發表單位：沈陽藥科大學無涯創新學院；Massachusetts General Hospital

發表時間：2022年8月

DOI：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1889233/v1

研究背景

近紅外(NIR)熒光成像技術是近年發展起來的新技術，由于近紅外光的吸收和散射較低，是用于檢查骨折、骨損傷和關節異常等骨疾病理想的成像窗口。

哈佛大學醫學院與麻省總醫院Kang博士/Hak Soo Choi博士研究團隊基于結構固有靶向性(SIT)策略，對某種NIR-I區熒光染料進行了修飾，使其能夠同時在NIR-I和NIR-II區各有一個峰值，被用于活體體內成像。

2022年10月發表于《Biomaterials Research》，我們對文章中近紅外熒光成像的有關應用進行解讀，為活體成像實驗提供更多的參考。
研究方法

研究人員用硫取代中間碳原子，合成了骨靶向近紅外熒光團，發生紅移并增加了熒光強度。對新合成的骨靶向近紅外熒光團水溶液依次進行了物理化學、光學和熱穩定性的研究。在動物模型中進行了鈣結合、骨靶向特異性、生物分布、藥代動力學、2D和3D熒光斷層掃描成像。

動物模型

CD-1小鼠（6-8周齡，雄性）、NCr Nu/Nu裸鼠（6周，雄性）在成像前5天喂食無葉綠素的鼠糧，以減少自發熒光。為了研究體內分布和清除情況，配置0.25-1.0mM近紅外熒光團注射用液。

成像前4h異氟醚麻醉，眼靜脈叢注射近紅外熒光團100μl (25-100nmol)。NIR熒光成像后處死小鼠，取心、肺、肝、胰腺、脾、腎、十二指腸、小腸和肌肉等主要器官，進行組織成像。

近紅外熒光成像

為了評價骨靶向能力、體內分布以及腎臟清除率。20g CD-1小鼠經靜脈注射50nmol (2.5mg/kg) P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG；注射4h后，移除所有內臟器官，仰臥姿勢固定，進行全身骨成像。

為了評價P800SO3-PEG骨靶向結合穩定性。NCr Nu/Nu裸鼠，眼靜脈叢注射P800SO3-PEG 50nmol (2.5mg/kg)，利用NIR-II區成像和NIR-I三維熒光斷層掃描成像系統分別進行兩次成像，分別觀察骨信號隨時間的動態變化。

我們對文章中近紅外成像設備技術參數進行了整理歸納，見下表：

 

表1.近紅外成像設備技術參數設計

NIR-I 區成像		NIR-II 區成像
激發光 (11mW/cm2)	760nm	光纖耦合激發光 (35mW/cm2)	808nm
長通濾光片	785nm	長通濾光片	1070nm
白光	400–650nm	拍攝相機	640×512-pixel
三維熒光斷層掃描成像
CT 掃描參數		FLECT 掃描參數
管電壓	31 kV	激發光	780nm
管電流	500 µA	濾光片	853nm
曝光時間	150 ms	曝光時間	17.5 ms
360°覆蓋掃描	720 幀投影	360°覆蓋掃描	116幀投影
圖像分辨率	25×25×25 um	圖像分辨率	1×1×1 mm
時長	15min	時長	33 min 12s
TriFoil Imaging VivoQuant v2.5:結合CT 、FLECT掃描數據重建三維圖像

定量分析

對成像結果感興趣區域(ROI)，進行熒光/背景的量化。在每個時間點，至少分析三只小鼠，通過Image J計算信號背景比(SBR)。結果用非配對t檢驗或單因素方差分析(ANOVA)進行統計分析；數據使用Prism9.2.0可視化。

SBR=熒光強度/背景；其中背景是鄰近組織的信號強度，如肌肉或皮膚等

骨組織近紅外熒光顯微鏡

為了測定近紅外熒光團的骨組織分布，CD-1小鼠注射100ul P800SO3-PEG（50nmol），分別于第1天和14天取小鼠骨組織。修剪解剖骨組織，直接包埋于Tissue-Tek OCT中，-80℃冷凍保存。用冷凍切片機切割10μm的冷凍切片。對切片進行熒光分析后進行HE染色。

設置成像參數：710±25nm的激發濾光片、785nm二向色鏡和810±20nm的發射濾光片，調整曝光度和視野成像。

部分研究結果

結構設計與光學性質

與P800SO3相比，其他三組改進的近紅外熒光團均顯示出明顯的NIR-II信號，并且λem隨著取代基團能量的減少而增加，能夠使熒光尾發射區域從NIR-I延伸到NIR-II窗口(NIR-I：Ex760nm，Em785nm；NIR-II：Ex808nm，Em1,070nm)。

當二磷酸七甲胺中間C原子被取代后，可以有效提高NIR窗口的最大吸收波長和紅移系數，增加熒光強度(λemP800SO3=802nm；λemP800SO3-Cl=817nm；λemP800SO3-SH=845nm；λemP800SO3-PEG=847 nm)（圖1)。

 

圖1.骨靶向造影劑結構設計與光學性質

P800SO3-PEG是NIR-I區花菁染料修飾后，發生紅移并增加熒光強度，能夠在NIR-I和NIR-II兩個窗口進行熒光成像。改善了光學性能，提高了光照敏感性，增強激發后產生的光熱效應（圖2）。

 

圖2.骨靶向造影劑-P800SO3-PEG

骨靶向性和體內分布

CD-1小鼠摘除所有內臟器官后，仰臥姿勢進行全身骨成像。結果表明，小鼠的胸椎、腰椎和骶椎，以及背側肋骨、髂骨和膝關節部位，均表現出很強的熒光信號（圖3a，b）。

P800SO3-Cl在肌肉和皮膚中表現出較高的非特異性結合，SBR最低(NIR-I，2.3；NIR-II，3.9)。P800SO3-PEG的背景信號最低，骨靶向結合效果最好；NIR-II窗口組織散射較低，SBR值(SBR≈6.0)顯著高于NIR-I(SBR≈3.5)(圖3c)。

研究人員比較了P800SO3-PEG在兩個NIR窗口成像的分辨率，進行小鼠尾椎骨精細成像(圖3d)。可以看到，NIR-II的尾椎骨圖像SBR值為2.4，比NIR-I(SBR≈1.3)高2倍左右;FWHM在NIR-II為100±0.01mm（圖3e）。

圖3.P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG骨靶向性和體內分布成像

（a）全身骨成像

（b）膝關節成像；color (上)，NIR-I (中)，NIR-II (下）；

（c）骨膝關節及臨近肌肉組織的SBR值(n = 3, mean ± S.D)；

（d）尾骨NIR-I和NIR-II成像結果

（e）對圖d白色虛線標記的區域進行FWHM 分析

P800SO3-PEG 藥代動力學參數測定

研究人員為了評價腎臟清除率，通過對CD-1小鼠眼靜脈叢注射P800SO3-PEG（25 nmol），測定血液中P800SO3-PEG動態變化（圖4a）

結果表明，P800SO3-PEG的體內分布和清除速度較快(t1/2α=1.53min，t1/2β=21.7min）。此外，P800SO3-PEG曲線下面積(AUC)較小，清除率較高(0.23mL/min)，能夠在4h內快速代謝清除(4% ID)。

P800SO3-PEG骨基質結合穩定性

研究人員選用NCr Nu/Nu 裸鼠，靜脈注射P800SO3-PEG (50nmol，2.5 mg/kg)后，觀察14天內骨基質信號的動態變化(圖4b)。

P800SO3-PEG能夠靶向結合小鼠的顱骨、肩胛骨、脊椎、髂骨和部分股骨；熒光強度逐漸升高，并在第4天達到峰值；能夠穩定與顱骨、脊椎等骨基質結合。

圖4c 比較了CD-1小鼠，靜脈注射 P800SO3-PEG第1天和14天小鼠的膝蓋、顱骨、脊椎和尾椎骨成像，觀察骨信號分布隨時間的變化（圖c）：

1）在膝關節中，骨骺和干骺是骨代謝活躍區域，隨著時間的推移，信號減少或消失，并重新分布到脛骨和股骨中。2）生長板（軟骨）中沒有信號。3)顱骨和上頜骨，邊緣輪廓信號隨著時間的推移變得更加明顯，如脊椎(包括胸椎，腰椎和骶椎) ，髂骨和部分背側肋骨。4）棘突中的信號逐漸減少，而橫突中的信號維持不變。5）裸鼠的精確尾椎骨成像，P800SO3-PEG積聚兩周后，每節尾錐表現出明顯區分的高信號強度。6）椎間盤（纖維軟骨）中沒有熒光信號。

第1天的骨縱向分析顯微鏡結果表明(圖4d)，骨表面的熒光信號為軟骨(白色箭頭)，注射后第14天的成像結果表明，P800SO3能夠穩定地融入骨基質中(黃色箭頭)。隨著時間的推移，游離的P800SO3-PEG沉積在正常骨基質頂部。松質骨的微結構圖像分析表明，該區域有著高周轉率(即藍色虛線)或延遲的新骨沉積(無熒光)。

圖4.P800SO3-PEG骨基質結合穩定性

（a）P800SO3-PEG藥代動力學參數；

（b）P800SO3-PEG在裸鼠體內的生物分布(n = 3, mean ± S.D)；

（c）P800SO3-PEG第1天和14天骨基質NIR-II成像

（d) 切除的骨組織進行H&E和NIR成像

P800SO3-PEG的三維熒光斷層掃描成像結果

研究人員通過三維活體斷層掃描InSyTe FLECT/CT成像系統，檢測了NCr Nu/Nu 裸鼠在靜脈注射P800SO3-PEG (100nmol，2.5mg/kg）后第4天，在NIR-I區體內生物分布成像。

FLECT/CT成像結果表明，P800SO3-PEG在注射后4天時表現出明顯的骨靶向結合，主要集中在脊椎和骨關節中。

在不同骨組織中，優先積累在骨代謝活躍區域；腎臟殘留的弱信號，說明P800SO3-PEG具有穩定快速的腎清除率。冠狀位和矢狀位圖像表明，P800SO3-PEG能夠在膝蓋、肩胛骨和脊椎中大量積累，未表現出其它組織的非特異性結合。

 

圖5.P800SO3-PEG的三維熒光斷層掃描成像

（a）活體成像-全身成像；

（b、c）冠狀位、矢狀位和橫截面區域成像

研究結論

P00SO3-PEG 是具有骨靶向的花菁素熒光染料，對骨組織具有較高的親和力和成像能力，主要器官的非特異性結合最小，激光照射時具有光熱效應。P800SO3-PEG是近紅外成像的最佳骨靶向造影劑，具有在實時和非放射性骨成像的應用潛力，有堅實的用于診斷治療臨床轉化前景。

活體近紅外成像在此研究項目中的應用

P800SO3-PEG的熒光發射波長主要集中在NIR-I 區，研究人員對全身骨結構進行NIR-I區的三維熒光斷層掃描成像，檢測在不同骨組織中的生物分布。

傳統小動物2D成像設備做不到文章中無創、實時骨組織NIR-I區熒光成像，是因為組織穿透低，熒光信號會被皮毛、肌肉、血液等背景熒光阻擋。

Trifoil FLECT/CT有效地解決了NIR-I區組織穿透限制這一成像難題，能夠對深層組織、器官進行高分辨率成像。通過熒光斷層掃描技術，獲得真實的三維圖像和數據，能夠重建骨結構精細圖像。同時能夠多維度進行ROI區域放大分析，為科研人員提供更高質量的數據。

若您想要了解更多關于FLECT/CT成像系統的內容，或預約使用FLECT/CT設備進行相關實驗，歡迎您通過以下方式聯系我們：

孫元元（技術部）
Tel：13810818543
柴丹（銷售部）
Tel：13810910943
田建華（應用工程師）
Tel：18302907782
張婷瑞（應用工程師）
Tel：13910490151
聯系郵箱：sales@bio-one.cn

訪問以下網站了解更多關于小動物3D熒光斷層掃描成像的詳細內容：https://www.trifoilimaging.com
    作為TriFoil Imaging在中國的銷售服務商和技術服務中心，承接了TriFoil Imaging收購的前公司所有設備維修、維護，包括GE公司的小動物CT、SPECT/CT以及BioScan公司的光學成像系統。歡迎您關注我們的微信公眾號以查看更多相關報道。歡迎您就產品、應用及實驗等感興趣的方面與我們交流。