姍姍來遲的世界杯，總算給朋友圈提供了第二談資。32支球隊(duì)，有傳統(tǒng)強(qiáng)隊(duì)，也有后起之秀。為了捧起大力神杯，各家紛紛使出十八般武藝。這種熱鬧場面，好比盛況空前的生物制藥市場。Me-Too和Me-Better都講究速度與激情，抓住工藝的CPP，才能俘獲CQA的芳心。

今天小編就從時下熱點(diǎn)——質(zhì)粒 入手，分享上下游工藝中的“捧杯”秘籍。

質(zhì)粒DNA應(yīng)用

細(xì)胞和基因治療技術(shù)已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域最近幾年的新熱點(diǎn)，同時帶動了相關(guān)生物技術(shù)和產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。質(zhì)粒DNA，既可以作為核酸疫苗或核酸藥物單獨(dú)使用，也可作為mRNA藥物生產(chǎn)中的模板材料，還可以在重組病毒載體生產(chǎn)中作為病毒包裝的原料。隨著細(xì)胞和基因治療、mRNA藥物的飛速發(fā)展，質(zhì)粒DNA的需求與日俱增。因此，制備高純度、高質(zhì)量的超螺旋DNA，始終是細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域企業(yè)的重要工作目標(biāo)。

質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝流程圖（經(jīng)典三步法）
 
質(zhì)粒DNA生產(chǎn)流程

1   大腸桿菌發(fā)酵
發(fā)酵主要是在感受態(tài)選擇、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、營養(yǎng)物質(zhì)、溶氧、pH、溫度等方面進(jìn)行優(yōu)化。質(zhì)粒的擴(kuò)增得益于大腸桿菌規(guī)模化高密度發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)，如何進(jìn)行高密度發(fā)酵，并在有限的發(fā)酵液中得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，減少下游純化壓力，是上游發(fā)酵需要持續(xù)解決優(yōu)化的方向。

2  菌體收集
發(fā)酵結(jié)束，通常采用離心的方式收集菌體。考慮中試放大的可行性，規(guī)模化生產(chǎn)建議采用中空纖維切向流過濾收菌的方式，推薦使用750KD或0.1、0.2μm的中空纖維。

3  菌體裂解
最經(jīng)典裂解工藝還是三步堿裂解法，重懸（50mM Glucose，25mM Tris，10mM EDTA ，pH 7.5~8.0）→堿裂解（0.2 M NaOH ，1% SDS）→中和（3M 乙酸鉀， 2M CH3COOH pH 5.0）。小試階段通常采用手動操作，由于手動操作的不確定性及不可放大性，會出現(xiàn)不同批次裂解效果不同的差異，中試放大后，存在裂解效率降低，開環(huán)占比增加的風(fēng)險(xiǎn)；因此保證產(chǎn)品中試階段高質(zhì)量的穩(wěn)定性，批次間一致性，也是工藝人員需要考慮的重點(diǎn)。

4  澄清
裂解中和后的液體，存在很多固體雜質(zhì)，需要澄清后才能進(jìn)行下一步工序。通常選擇嚢式濾器或深層濾器過濾澄清。

5  超濾濃縮
澄清后上清液通常采用50KD或100KD的切向流超濾膜組件進(jìn)行合理的濃縮和洗濾，以達(dá)到方便下一步層析純化的要求。在大規(guī)模質(zhì)粒生產(chǎn)時，需要提高工藝可放大性和合規(guī)性。其中，材質(zhì)和孔徑選擇、TMP優(yōu)化和剪切力是比較關(guān)鍵的地方。

6  層析純化
6.1 凝膠過濾層析
使用百林科Chromstar 6FF純化，此過程工藝目的是去除RNA。在合適的鹽濃度下，質(zhì)粒和RNA分子大小差異最大。樣品流經(jīng)層析柱，質(zhì)粒先出，RNA后出，從而實(shí)現(xiàn)分離。上樣量在0.1~0.25CV之間，推薦上樣線性流速60 cm/h，工藝放大柱高建議30±5 cm，具體參數(shù)條件建議客戶根據(jù)實(shí)際工藝情況進(jìn)行摸索。

Buffer A：2.1M (NH4)₂SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
 

結(jié)果：Chromstar 6FF 柱純化后，質(zhì)粒與RNA有效分離。

6  層析純化
6.2 親和層析
此步驟工藝目的去除開環(huán)質(zhì)粒等雜質(zhì)。百林科MaXtar PlasmidCap HR填料能夠特異性的結(jié)合超螺旋質(zhì)粒，載量達(dá)到2mg/ml。樣品流經(jīng)層析柱，在合適工藝條件下，開環(huán)質(zhì)粒流穿，超螺旋質(zhì)粒結(jié)合在填料上，經(jīng)洗脫收集，從而實(shí)現(xiàn)超螺旋質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒的高效分離，此層析步驟還有去除HCD的能力。

典型Buffer推薦如下：

• Buffer A: 2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
• Buffer B: 1.7M (NH4)2SO4，0.3M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl pH 7.5

 

結(jié)果：MaXtar PlasmidCap HR填料純化質(zhì)粒樣品可實(shí)現(xiàn)對開環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒的完全分離，超螺旋質(zhì)粒純度可以達(dá)到90%以上。
 
6  層析純化
6.3 離子交換層析
經(jīng)過Chromstar 6FF和MaXtar PlasmidCap HR純化后的超螺旋質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量已經(jīng)很低，經(jīng)過MaXtar Q HR進(jìn)一步純化，可以有效將內(nèi)毒素控制在合格范圍內(nèi)。

典型Buffer推薦如下：
Buffer A：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
Buffer B：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
 

結(jié)果：經(jīng)MaXtar Q HR填料純化后，回收率＞85%，內(nèi)毒素含量＜10EU/mg。
 
* 根據(jù)超螺旋質(zhì)粒含量計(jì)算

7  濃縮換液
純化后超螺旋質(zhì)粒經(jīng)過UF/DF調(diào)整濃度及置換緩沖液，除菌過濾，儲存?zhèn)溆谩?br />
質(zhì)粒三步法的工藝優(yōu)勢

層析三步法已廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域，適合建立平臺化的質(zhì)粒純化方案，以減少工藝開發(fā)工作量。相較于其他質(zhì)粒工藝路線，適用于不同大小分子范圍，面對不同質(zhì)粒的上游表達(dá)量，RNA等雜質(zhì)含量以及發(fā)酵的批間差異，能夠最大程度保證產(chǎn)品質(zhì)量，平臺通用性較強(qiáng)，優(yōu)勢明顯。
與此同時，百林科也可以根據(jù)客戶不同應(yīng)用的質(zhì)量需求定制開發(fā)純化路線。

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