蛋白質組學助力發現酒精相關肝病新生物標志物
編者按
酒精相關肝病（ALD）具有三個關鍵病理特征——纖維化、炎癥和脂肪變性，但至今對于其病理機制仍不清楚。本研究開發了一種配對的肝-血漿蛋白質組學方法來推斷分子病理生理學，并探索該血漿蛋白質組學在596名參與者（137名對照個體和459名ALD患者）的診斷和預后判斷方面的潛能，其中360名患者同時進行了基于活檢的組織學評估。研究者通過使用基于質譜（MS）的蛋白質組學工作流程，分析了所有血漿樣本和79例肝臟活檢。在血漿和肝活檢組織中，代謝功能下調，而纖維化相關的信號傳導和免疫反應增強。通過機器學習模型識別出蛋白質組學生物標志物（檢測到顯著的纖維化和輕度炎癥），其準確性比現有的臨床分析更準確。一個獨立的驗證隊列驗證了診斷模型的性能，為常規的基于MS的肝病檢測奠定了基礎。
一. 文章詳情
文章題目：Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease
中文題目：蛋白質組學助力發現酒精相關肝病新生物標志物
發表時間：2022.06
期刊名稱：nature medicine
影響因子：87.241
實驗平臺：LC–MS/MS質譜檢測
DOI: 10.1038/s41591-022-01850-y
二. 研究內容
患者、數據收集和研究設計
研究樣本包括三個隊列：（1）ALD患者隊列（GALA–ALD；n=459，其中79例為組織-血漿配對患者）；（2）健康對照隊列（GALA–HP，n=137）；（3）ALD驗證隊列（GALA–ALD，n=63）。技術路線：通過使用數據獨立采集（DIA）和液相色譜系統獲得了所有參與者（n=659）的蛋白質組譜圖，包括對GALA-ALD隊列中459例ALD患者的血漿樣本和79份肝組織的蛋白質組學分析。然后將血漿蛋白質組學數據和機器學習相結合，構建了用于檢測早期纖維化（F2）、炎癥（I2）和脂肪變性（S0）的預測模型。最后在ALD驗證隊列進行驗證。
肝臟病變對肝臟和血漿蛋白質組的影響
肝臟蛋白質組共鑒定出717個與脂肪變性、纖維化、脂肪肝炎相關的差異蛋白，其中與纖維化相關的蛋白有658個，與炎癥活動相關的蛋白有135個，與脂肪變性相關的蛋白有68個。其中纖維化對肝臟蛋白質組的影響最大，其次是炎癥，同時炎癥中84%的失調蛋白也在纖維化過程中被發現。隨著纖維化的發展，肝組織中注釋為“肝特異性”的蛋白表達下調；80%的”分泌“蛋白表達上調。相關性分析發現，在與脂肪變性、纖維化和脂肪肝炎相關的排名前20 的差異蛋白中，與纖維化階段最相關的是肝臟的分泌蛋白；與炎癥相關的蛋白中有50%是細胞骨架蛋白（說明肝臟炎癥會導致細胞結構發生變化）；與脂肪變性相關的蛋白中，發現了PLIN2和FABP4蛋白。綜合以上結果，有225個蛋白顯著差異豐富，包括206個纖維化的相關蛋白、163個炎癥活性相關蛋白和48個脂肪變性相關蛋白，構成了肝臟血漿蛋白質組重構。隨著纖維化的發展，134個蛋白表達上調，91個蛋白表達下調。在這些注釋為肝臟特異性或分泌的異常蛋白中，分別有83%和64%下調。
肝組織和血漿蛋白質組學的整合
研究中對肝臟和血漿中的420種蛋白質進行了定量，結果顯示，這些蛋白質在二維空間中的水平分化為兩簇。“對角線簇”表示這些蛋白質的相對豐度等級在很大程度上與在肝臟和血漿中具有相關性，而“垂直簇”則相關性較弱。在這些常見檢測到的蛋白中，有112個蛋白在配對的肝臟和血漿樣本之間存在顯著相關性。共有46個蛋白在肝臟和血漿蛋白組中均存在顯著差異（統稱為失調蛋白），并且這些失調蛋白主要參與免疫和炎癥反應、ECM組織、蛋白酶抑制劑和細胞粘附等。從纖維化期F0到F4，大多數協同調節蛋白大量增加，少數蛋白在組織和血漿中表達不一致，研究者推測這可能是由于血漿水平是反映組織滲漏和肝臟合成受損的綜合結果。
ALD 早期病理學的生物標志物
研究人員比較了22種最先進的機器學習分類器，確定了邏輯回歸模型作為最終分類器，使用“最小冗余-最大相關性”（mRMR）特征選擇算法，選定了選擇蛋白標記物（共22種蛋白質）來識別顯著肝纖維化（9種）、輕度炎癥活動（6種）和肝脂肪變性（12種）。基于Logistic回歸模型的平均交叉驗證來預測顯著纖維化、輕度炎癥活動和脂肪變性，結果顯示，三組蛋白標志物組合模型的平均ROC-AUC 分別為0.90 、0.85和0.91，具有良好的診斷效能。與15種最先進的臨床測試模型相比，蛋白質組學模型具有最高的F1分數和準確性。
在驗證隊列中進行模型性能的驗證
蛋白質組學模型正確排除健康、匹配的對照組(n=136)隊列中的顯著纖維化、晚期纖維化和輕度炎癥的準確率分別為99%、100%和98%；對于有酒精濫用史和低肝硬化而未進行活檢的患者(n=97)，其準確率分別為93%和100%。在ALD驗證隊列（n=63）中，F2和I2蛋白質組學模型產生的ROC-AUC值分別為0.87和0.81，明顯高于隊列中其他10種同類模型。將蛋白質組學模型與其他商業生物標志物和肝纖維化的組織學分期進行比較，結果顯示，F2蛋白質組學模型顯示最高的鑒別精度的預測顯著高于F3和I2蛋白質組學模型。綜上所述，這項研究構建的蛋白質組學模型是準確的預后指標。
三. 主要結論
本研究通過ALD患者、健康對照和ALD驗證隊列的肝臟和血漿DIA蛋白組學研究，發現肝臟和血漿均發生顯著的蛋白質組重構。通過基于質譜的蛋白組學和機器學習模型相結合，確定了準確檢測ALD中的纖維化、炎癥和脂肪變性三種相關病理狀態的蛋白生物標志物組合，同時也在驗證隊列中得到了驗證。通過深入的肝臟圖譜，可以對血漿和組織變化進行更詳細的功能比較。總之，本研究不僅證實了先前的研究結果，同時也提供了具有診斷、預后和治療價值的潛在蛋白靶點，對潛在的ALD治療方案的發展有重要意義。
四. 參考文獻
Niu L, Thiele M, Geyer PE, et al. Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease. Nat Med. 2022;28(6):1277-1287. doi:10.1038/s41591-022-01850-y
