利用磷酸化組和代謝組揭示膿毒癥中EGFR胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制
敗血癥是指機體對病原體感染的先天免疫反應(yīng)失調(diào)，可導(dǎo)致組織損傷，甚至危及生命。巨噬細胞的持續(xù)激活可能是加速膿毒癥反應(yīng)的機制。而巨噬細胞中的代謝級聯(lián)反應(yīng)被認為是其激活的特征。EGFR(表皮生長因子受體)是一種跨膜受體酪氨酸激酶，可與TLR4（Toll 樣受體 4）共同調(diào)節(jié)內(nèi)毒素血癥中巨噬細胞的激活，EGFR的磷酸化增加了TLR4細胞表面表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，巨噬細胞中EGFR在LPS（脂多糖）作用下的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程及其生理意義尚不清楚。
2022年11月，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科唐靖課題組與解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院劉志峰課題組合作在Cell Death & Disease（IF9.685 ）期刊上發(fā)表了題為“EGFR tyrosine kinase activity and Rab GTPases coordinate EGFR trafficking to regulate macrophage activation in sepsis”的文章，該研究利用磷酸化修飾組和代謝組學(xué)等方法發(fā)現(xiàn)LPS可增加巨噬細胞表面EGFR的表達，Rab10有助于EGFR的質(zhì)膜運輸。Rab5a介導(dǎo)早期EGFR內(nèi)吞，而EGFR/MAPK14/Rab7a調(diào)節(jié)晚期EGFR內(nèi)吞。此外，抑制細胞表面EGFR表達降低M1極化，并通過激活ppar γ介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝促進M2極化。 最后，抑制EGFR磷酸化使巨噬細胞的平衡從M1向M2傾斜，并減弱了LPS誘導(dǎo)的炎癥和組織損傷。中科新生命提供了磷酸化修飾組和非靶向代謝組技術(shù)服務(wù)支持。
步驟1：LPS促進巨噬細胞表面EGFR的激活和表達；
步驟2：EGFR/MAPK14/Rab7a（S72）調(diào)節(jié)晚期EGFR內(nèi)吞；
步驟3：Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細胞中的早期內(nèi)化；
步驟4：Rab10促進EGFR從高爾基體運輸?shù)郊毎砻妫?/p>
步驟5：抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細胞中M1極化、通過激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進M2極化；
步驟6：抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷。
研究結(jié)果
1. LPS促進巨噬細胞表面EGFR的激活和表達
本研究發(fā)現(xiàn)在BMDM和RAW264.7兩種巨噬細胞中證實LPS均可激活EGFR的細胞表面的表達（圖1A-1F）。在CLP(盲腸結(jié)扎穿刺)誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型和臨床急性膿毒癥患者中，巨噬細胞表面的EGFR的表達量均較正常組明顯升高(圖1G-1K)。綜上所述，LPS誘導(dǎo)膿毒癥巨噬細胞表面EGFR的激活，并促進EGFR的表達。
圖1 LPS促進巨噬細胞表面EGFR的表達LPS促進巨噬細胞表面EGFR的表達
2. Rab7a的S72磷酸化促進晚期EGFR內(nèi)吞
抑制EGFR磷酸化顯著降低了巨噬細胞膜中EGFR的表達，提示EGFR激酶活性在受體運輸中起重要作用。為了發(fā)現(xiàn)EGFR激酶新的下游靶點，作者采用定量磷酸化修飾蛋白組學(xué)的方法對RAW264.7細胞進行分析(對照組、LPS處理組、EGFR抑制劑（PD168393）+LPS共同處理組)�？偣卜治隽�11772個獨特的磷酸位點，對應(yīng)了8151個肽片段、3041個獨特的蛋白質(zhì)。磷酸化修飾組學(xué)中的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)磷酸化肽主要富集于MAPK信號通路、內(nèi)吞和糖酵解通路（圖2B）。在差異的磷酸化肽段中，只有Rab7a被報道參與了細胞內(nèi)吞通路，Rab7a GTPase參與調(diào)節(jié)胞吞介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運，特別是Rab7A促進了生長因子受體等膜受體從早期核內(nèi)體到晚期核內(nèi)體和溶酶體的運輸，因此作者重點研究了RAB7a磷酸化與EGFR轉(zhuǎn)運之間的關(guān)系。修飾組學(xué)發(fā)現(xiàn)Rab7a在S72位發(fā)生磷酸化修飾（圖2C-2D）（經(jīng)WB和點突變、模擬突變方式證實RAB7a在S72發(fā)生了磷酸化修飾（圖3A-3D））。為研究S72磷酸化對Rab7a的GTPase活性的影響，作者分析了LPS處理的巨噬細胞中， Rab7a與CD63(晚期核內(nèi)體)、LAMP1(自噬體成熟階段相關(guān)蛋白)的共定位（圖3E-3J），結(jié)果表明Rab7a磷酸化調(diào)節(jié)了EGFR的后期內(nèi)吞降解，從而影響了EGFR的膜表達。
圖2 磷酸化修飾組學(xué)KEGG通路和差異表達肽段分析
圖3 Rab7a的S72磷酸化促進晚期EGFR內(nèi)吞
3. MAPK14磷酸化Rab7a的S72位點
根據(jù)磷酸化修飾組學(xué)的結(jié)果，作者推測Rab7a的S72磷酸化是受EGFR/MAPK14通路影響的。作者通過共定位（圖4A）以及體外、體內(nèi)（加入MAPK14抑制劑）共沉淀(圖4B-4E)和MAPK14/ Rab7a-S72點突變(圖4G)的方式證實了MAPK14可以直接結(jié)合并磷酸化Rab7a，Rab7a S72是MAPK14磷酸化的主要位點。為了了解MAPK14介導(dǎo)的Rab7a磷酸化在EGFR細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運調(diào)控中的作用，作者分析了MAPK14敲除和CD63、LAMP1的共定位（圖4D-4O），結(jié)果表明MAPK14介導(dǎo)的Rab7a磷酸化調(diào)控了LPS激活的巨噬細胞的晚期內(nèi)吞和EGFR降解。
圖4 MAPK14磷酸化Rab7a的S72位點
4. Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細胞中的早期內(nèi)化
生長因子受體的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運是EGFR信號通路時空調(diào)控的重要細胞機制之一。研究發(fā)現(xiàn)LPS處理巨噬細胞1小時后，PD168393預(yù)處理組中早期核內(nèi)體(EEA1)和EGFR之間的共定位減弱。由于Rab5a是細胞內(nèi)吞作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作者將Rab5a與EGFR進行了免疫共沉淀和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)了兩者的共定位。隨后通過Rab5a的敲除以及其效應(yīng)蛋白抑制劑的添加、Rab5a敲除小鼠的驗證，證實LPS誘導(dǎo)的EGFR早期內(nèi)化是由Rab5a介導(dǎo)的（圖5）。
圖5 Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細胞中的早期內(nèi)化
5. Rab10促進EGFR從高爾基體運輸?shù)郊毎砻?/strong>
為了尋找EGFR細胞表面表達的細胞調(diào)控機制，作者將重點放在Ras家族的小g蛋白上。Rab10主要參與蛋白質(zhì)從高爾基體到質(zhì)膜的運輸。作者發(fā)現(xiàn)Rab10定位于高爾基體和EEA1，但不定位于晚期核內(nèi)體。同時，Rab10和EGFR共定位。此外，Rab10沉默的巨噬細胞表面EGFR表達明顯降低(圖6A-6G)。隨后通過構(gòu)建Rab10的突變細胞系及EGFR的表面表達，證實Rab10促進EGFR從高爾基體運輸?shù)郊毎砻妫▓D6H-6M）。
圖6 Rab10促進EGFR從高爾基體運輸?shù)郊毎砻?/em>
6. 抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細胞中糖酵解依賴性M1極化
為了評估細胞膜EGFR激活對膿毒癥巨噬細胞M1/M2表型平衡的影響，作者使用LPS刺激BMDMs和RAW264.7兩種巨噬細胞向M1表型轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)PD168393處理和Erlotinib處理（EGFR抑制劑）均顯著下調(diào)了M1標(biāo)志物iNOS的表達水平，即表明細胞表面的EGFR磷酸化促進內(nèi)毒素血癥或敗血癥相關(guān)的M1巨噬細胞的激活。為了進一步闡明EGFR對內(nèi)毒素血癥代謝的影響，作者開展了代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明LPS組磷酸戊糖通路(PPP)和糖酵解中間產(chǎn)物增加、PD168393的處理降低HIF-1ɑ和乳酸脫氫酶A (LDHA)蛋白表達。綜上所述，抑制EGFR磷酸化可以減少巨噬細胞對LPS的糖酵解反應(yīng)（圖7）。
圖7 抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細胞中糖酵解依賴性M1極化
7. 抑制EGFR磷酸化通過激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進M2極化
作者接進一步研究了EGFR磷酸化在M2表型極化中的作用，結(jié)果表明Erlotinib處理后，M2標(biāo)志物CD206在細胞和小鼠體內(nèi)均顯著增加，即意味著抑制EGFR磷酸化促進膿毒癥期間M2巨噬細胞極化（圖8A-8J）。PPARγ控制巨噬細胞谷氨酰胺代謝，在M2極化和代謝之間提供聯(lián)系，而M2極化需要谷氨酰胺。代謝組學(xué)分析表明，PD168393處理后谷氨酰胺水平升高，且PD168393顯著促進了PPARγ的激活，CD206的表達隨著PPARγ的激活而增加(圖8J-8K)。綜上所述，抑制EGFR磷酸化通過激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝從而促進M2極化。
圖8 抑制EGFR磷酸化通過激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進M2極化
8. 抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷
為了進一步驗證EGFR抑制劑在體內(nèi)對炎癥和巨噬細胞極化的影響，應(yīng)用LPS和CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，在給予Erlotini的小鼠中，M2標(biāo)志物CD206的表達增加，而M1標(biāo)志物iNOS的表達減少。此外，Erlotini明顯減少了中性粒細胞的浸潤減弱了炎癥細胞浸潤、間質(zhì)水腫和肺泡間隔增厚。綜上表明，EGFR抑制劑可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細胞極化和減少炎癥來改善膿毒性（圖9）。
圖9 抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷
小編小結(jié)
該研究發(fā)現(xiàn)在LPS作用下，巨噬細胞表面EGFR的表達增強。然后通過磷酸化修飾組和代謝組學(xué)等方法揭示了EGFR的整個細胞轉(zhuǎn)運過程，包括質(zhì)膜易位、早期內(nèi)化和晚期內(nèi)吞，以及調(diào)控這些過程的特異性Rab蛋白的分子機制。此外，作者還發(fā)現(xiàn)細胞表面EGFR水平調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2極化表型轉(zhuǎn)化，并通過代謝重編程影響膿毒癥誘導(dǎo)的多器官損傷。該研究為EGFR作為膿毒癥治療的潛在靶點提供了有力的證據(jù)。
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