老年性耳聾(ARHL)是老年人中最常見的感覺(jué)障礙。目前，沒(méi)有治療方法可以有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)ARHL。老化的聽覺(jué)器官通常伴隨著氧化應(yīng)激和代謝惡化的加劇。隨著人口老齡化，ARHL的發(fā)病率增高，目前已經(jīng)成為老年人中三大最常見慢性病之一。
 

9月22日，國(guó)際知名期刊 Redox Biology（IF 10.787）在線發(fā)表了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院楊軍教授課題組題為“Dietary intake of deuterium oxide decrases cochlear metabolism and oxidative stress levels in a mouse model of age-related hearing loss ”的研究文章。文章主要采用代謝流技術(shù)研究了重水（D₂O）對(duì)ARHL小鼠模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D₂O補(bǔ)充劑可以通過(guò)減緩新陳代謝速度和減少耳蝸中的內(nèi)源性氧化應(yīng)激的產(chǎn)生來(lái)阻礙小鼠模型中ARHL的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)為保護(hù)耳蝸免受氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)新陳代謝以預(yù)防ARHL 開辟了新的途徑。中科新生命為本研究提供了代謝流檢測(cè)服務(wù)。

 
研究材料

DBA/2J 、CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠模型的耳蝸

 技術(shù)路線

步驟1：膳食 D₂O 補(bǔ)充劑可改善 DBA/2J 小鼠的ARHL和保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞；

步驟2：膳食D₂O補(bǔ)充劑可減少耳蝸中的內(nèi)源性氧化應(yīng)激；

步驟3：D₂O可減緩分解代謝反應(yīng)，并可能延緩與衰老有關(guān)的代謝過(guò)程；

步驟4：D₂O可以改善 C57BL/6J 和 CBA/CaJ 小鼠模型中的 ARHL，并減少耳蝸中的內(nèi)源性氧化應(yīng)激。

 研究結(jié)果

1. 膳食D₂O補(bǔ)充劑可改善DBA/2J小鼠的ARHL和保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞

研究者使用實(shí)驗(yàn)小鼠（使用的三種小鼠品系DBA/2J、C57BL/6J 和 CBA/ CaJ）從出生后第4周到第9周用10%D₂O處理，測(cè)量了小鼠飲用水量和小鼠體重，以確定每日D₂O處理對(duì)體重的影響。與對(duì)照組小鼠相比，處理組小鼠的飲水量和體重沒(méi)有顯著差異；通過(guò)分析4周齡、9周齡、20周齡和40周齡在4至32kHz頻率范圍內(nèi)對(duì)純音刺激的聽性腦干反應(yīng)（ABR）來(lái)估計(jì)聽力閾值（HT），DBA/ 2J小鼠表現(xiàn)出早發(fā)性(4周)，進(jìn)行性，高頻(>16 kHz)聽力損失 。在9周時(shí)，DBA / 2J小鼠的聽力水平與4周相比顯著升高。DBA/2J 處理小鼠在9周齡時(shí)測(cè)得的HT在8、11和16 kHz時(shí)顯著低于對(duì)照小鼠各自頻率的HT，這些發(fā)現(xiàn)與處理組和對(duì)照組小鼠耳蝸基部感覺(jué)上皮中外毛細(xì)胞（OHC）存活率的顯著差異相關(guān)。

圖1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的飲水量和體重變化

圖2 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J小鼠聽力的影響
 

2. 膳食D₂O補(bǔ)充劑可減少耳蝸中的內(nèi)源性氧化應(yīng)激

4-HNE（4-羥基壬烯醛）是脂質(zhì)過(guò)氧化的高活性副產(chǎn)物，被廣泛認(rèn)為是氧化應(yīng)激標(biāo)志物，可能觸發(fā)氧化應(yīng)激的細(xì)胞毒性作用。為了確定膳食D₂O補(bǔ)充劑是否影響耳蝸中的氧化應(yīng)激水平，對(duì)用抗4-HNE抗體免疫標(biāo)記的固定耳蝸切片進(jìn)行了共聚焦熒光成像 。研究表明NRF2/ARE/HO-1軸對(duì)噪聲引起的耳蝸氧化損傷具有保護(hù)作用。在9周年齡，與對(duì)照組小鼠相比，處理組中NRF2 和HO-1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著降低，并且在 DBA / 2J小鼠的螺旋神經(jīng)元（SGNs），柯蒂氏器（Co）和血管紋（SV）中也顯著降低。與DBA / 2J小鼠中各自的對(duì)照組相比，處理組中SGNs，Co和SV中的谷胱甘肽化蛋白水平降低。結(jié)果表明，膳食D2O補(bǔ)充劑降低了內(nèi)源性ROS水平，從而減少了對(duì)NRF2依賴性保護(hù)機(jī)制的需求。

圖3 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J小鼠耳蝸脂質(zhì)過(guò)氧化的影響


圖4 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中Nrf2表達(dá)的影響


圖5 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中HO-1表達(dá)的影響

圖6 膳食D₂O補(bǔ)充對(duì)DBA / 2J，C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠耳蝸中谷胱甘肽化蛋白表達(dá)的影響

3.  D₂O可減緩分解代謝反應(yīng)，并可能延緩與衰老有關(guān)的代謝過(guò)程

通過(guò)內(nèi)耳代謝流分析，比較了不同底物的代謝，包括25種氨基酸和參與糖酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物。結(jié)果顯示部分代謝物在處理組和對(duì)照組的耳蝸中差異表達(dá)。其中八種氨基酸（Lys、Cys、Pro、L-Argsuc、cytine、Val、Asn和Gly）在處理小鼠中1H和D均顯著增加。只有Asp在處理小鼠中顯示1H和D減少。葡萄糖代謝中，共檢測(cè)出18種糖酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物:處理組小鼠中葡萄糖、乳酸、3 PG、SUC、PYR和AKC顯示1H不變，D增加；F6P和DHAP顯示1H保持不變，D降低 。總之，代謝流分析表明，D₂O主要減緩涉及葡萄糖和氨基酸的分解代謝反應(yīng)，因此可能在一定程度上延緩與衰老相關(guān)的代謝惡化。

圖7 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J小鼠耳蝸代謝水平的影響


圖8 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J小鼠耳蝸中葡萄糖代謝和三羧酸循環(huán)(TCA)的影響


圖9 膳食D₂O補(bǔ)充劑對(duì)DBA / 2J小鼠耳蝸氨基酸代謝的影響
 

4. D₂O可以改善 C57BL/6J 和 CBA/CaJ 小鼠模型中的 ARHL，并減少耳蝸中的內(nèi)源性氧化應(yīng)激 

研究者使用另外兩種ARHL小鼠模型(C57BL / 6J小鼠和CBA / CaJ小鼠)來(lái)研究D₂O對(duì)ARHL進(jìn)展的影響。從4周齡開始使用10%的D₂O膳食補(bǔ)充劑，在C57BL / 6J和CBA / CaJ小鼠的耳蝸中，與對(duì)照小鼠相比，用作內(nèi)源性ROS標(biāo)志物的4-HNE在處理組小鼠的耳蝸中明顯減少。另一方面，免疫印跡和免疫熒光數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組耳蝸相比，處理組耳蝸中 Nrf2，HO-1和谷胱甘肽的表達(dá)均降低。Nrf2/HO-1途徑和谷胱甘肽代謝途徑也受到抑制。這些結(jié)果表明， D₂O可能會(huì)改善不同類型的ARHL。

小結(jié)

ARHL是一種具有多種因素的復(fù)雜疾病，研究者報(bào)告了膳食添加D₂O抑制了內(nèi)源性氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，減少了Nrf2/HO-1/谷胱甘肽軸的激活。代謝流分析表明D₂O減緩了葡萄糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，并在一定程度上延緩與衰老有關(guān)的代謝過(guò)程。D₂O補(bǔ)充劑可以通過(guò)減緩內(nèi)耳代謝速度和減少內(nèi)源性氧化應(yīng)激的產(chǎn)生來(lái)減少小鼠模型中ARHL的進(jìn)展。抗氧化基因表達(dá)的降低表明，D₂O可能繞過(guò)Nrf2/HO-1/谷胱甘肽軸，直接抑制耳蝸內(nèi)部ROS的產(chǎn)生，最終減少ARHL小鼠的聽力障礙。本研究為ARHL的臨床治療提供了新的思路。