什么技術能被RNA藥物領域領導者廣泛采用？

如mRNA藥物領域Moderna、BioNtech和CureVac等；ASO領域中Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等；siRNA領域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等；saRNA領域MiNA Therapeutics和中美瑞康等，及其他RNA療法公司。

隨著mRNA新冠疫苗成功，RNA藥物進入了快速發展階段。在全球范圍內，RNA療法為各國研究人員擴大藥物開發靶點范圍提供了獨特機會，其作用靶點的多樣性引起了領先的科研機構、新興生物技術公司和大制藥公司極大關注。

 

目前有多不同類型RNA療法在研發過程中，主要包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、Aptamer（核酸適配體）等等。

 

作為一類新的藥物治療形態，可對常規藥物分子無法靶向的蛋白質和基因進行選擇性作用，RNA核酸藥物已經在多種疾病中應用。

 

 

盡管RNA療法研發取得了非凡的進步，還有很多問題和挑戰需要克服，如RNA高度不穩定、體內遞送效率低、宿主細胞免疫原性等。RNA分子以藥物或靶向RNA小分子形式直接用于治療兩種模式。RNA藥物可利用內源性調節機制，并可特異性調節目標靶點。RNA藥物須通過細胞膜并具有結合細胞內靶標能力，并調控基因表達，進而實現相關蛋白質表達調節。

 

RNA療法基本原理

 

蛋白質表達水平檢測是藥理藥效研究非常重要的方面，目前有多種技術可以實現不同基質中分泌型和內源性蛋白質定量分析，例如ELISA技術，LC-MS技術、Western Blot技術等，也有一些創新性技術逐步被主流核酸藥物公司所采用，本文將介紹核酸藥物領導者采用什么技術解決研發中蛋白質分析問題。

 

 

案例1：Moderna--臨床前動物模型中蛋白質表達定量技術

Moderna公司目前在研臨床I期mRNA療法，mRNA-3927用于治療丙酸血癥（Propionic acidemia，PA）。

 

臨床前小鼠動物模型研究表明，雙RNA療法可恢復代謝功能。丙酸血癥是一種線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代謝紊亂，PCC由六個α(PCCA)和六個β(PCCB)亞基組成。采用編碼人類PCCA和PCCB的雙mRNA組合，裝載在可生物降解脂質納米顆粒（LNP）中，在肝臟中可產生功能性PCC酶。

 

雙mRNA編碼的蛋白質比單獨mRNA具有更高PCC酶活性。下圖a-c是比較雙RNA共轉染與hPCCA或hPCCB mRNA單獨轉染數據。a和d圖是酶活性評估，b和c圖是采用毛細管Digital Western定量檢測患者成纖維細胞中PCCA和PCCB蛋白質表達。

 

 

案例2：Arcturus Therapeutics--組織中定量檢測hOTC表達

Arcturus Therapeutics公司臨床階段mRNA療法ARCT-810用于治療鳥氨酸氨甲酰基轉移酶缺乏癥 (Ornithine Transcarbamylase Deficiency, OTCD)。該疾病是尿素循環障礙中最常見的一種遺傳性代謝病，OTC基因突變會導致高氨血癥發作。

 

脂質納米顆粒（LNP）裝載的OTC mRNA（LUNAR-OTC mRNA）利用專有的脂質藥物介導技術，可安全高效地將OTC mRNA遞送到肝細胞內，使患者自身肝細胞內能自然產生功能正常的OCT酶。進而，臨床前小鼠模型研究中，通過測量OTC-mRNA藥物處理后小鼠肝臟和血漿中OTC酶活性和蛋白質表達，來反映LUNAR-OTC mRNA藥物在小鼠模型中藥效。

 

人鳥氨酸轉氨甲酰酶 (hOTC) 在小鼠肝臟中蛋白表達。使用全自動毛細管Digital Western（Jess, Simple Western）系統定量檢測小鼠肝臟中hOTC 蛋白表達，以重組蛋白為校正曲線來進行定量。使用抗人OTC抗體，從四個遞增劑量組觀察到明顯的劑量反應，在未治療OTC缺陷組或未治療野生型組中未檢測到hOTC蛋白。OTC蛋白表達水平與肝臟樣本中OTC活性有很好的相關性。

 

 

案例3：Ionis Pharmaceuticals--ASO抑制RBM20可改善心力衰竭功能

射血分數（測量每次心臟收縮時離開心臟的血液百分比）保留的心力衰竭（HFpEF）是普遍和致命的。目前為止，沒有很好的靶向治療藥物。病因之一是心室充盈受損，德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心和Ionis Pharmaceuticals科學家使用靶向心臟剪接因子RBM20的反義寡核苷酸（ASO）可改善其功能。

 

在比剛度增加的成年小鼠中，2個月內每周給ASO可增加順應性肌動蛋白異構體表達，并改善心臟功能。人類工程心臟組織中驗證結果顯示，在ASO治療3周內RBM20表達下調至不到50%，導致沒有心臟病理狀況下適應性松弛動力學。本研究表明，抗RBM20 ASO可作為強大的心臟剪接調節劑，治療人類HFpEF。

 

注射RBM20 ASO有效抑制小鼠心臟RBM20表達。(B)圖是小鼠體內實驗設計，(C)用PBS或ASO處理的野生型(WT)和N2B敲除 (KO) 小鼠心臟組織中的Rbm20 mRNA表達，（D和E）采用全自動毛細管Digital Western檢測相應的RBM20蛋白表達豐度。mRNA和蛋白表達分子水平上，RBM20表達豐度下調50%以上。

 

全自動毛細管Digital Western技術是核酸藥物研發中蛋白質表達定量先進工具

以上Moderna、Arcturus Therapeutics和Ionis Pharmaceuticals三個案例是Digital Western代表案例，此技術已經廣泛被RNA藥物領域領導者采用。如mRNA藥物領域的Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO方面Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA領域Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA領域MiNA Therapeutics和中美瑞康等采用，及其他RNA療法公司。

 

全自動毛細管Digital Western技術作為創新性毛細管電泳免疫學技術，將Western Blot技術和ELISA技術合二為一，可利用微量組織樣本實現內源性蛋白質精準的相對定量和絕對定量。作為創新型生物分析方法，其具備傳統Western Blot蛋白質分子量可視化優勢，定性更準確，同時具備ELISA和MS技術精準定量性能，其靈敏度和精密度符合高標準生物分析要求。

 

針對RNA療法應用的技術優勢

1) Digital Western技術適合RNA療法體外和體內各種模型中靶蛋白表達定量分析，用于細胞系、類器官模型、小鼠動物模型和非人靈長類動物模型的關鍵蛋白質分析;

 

2) Digital Western技術樣本量需求是傳統Western Blot幾十分之一，只需要3μL樣本就可實現多重蛋白質表達檢測，特別適合微量珍貴樣本蛋白質分析;

 

3) Digital Western精準定量檢測，傳統Western Blot只能滿足樣本半定量需求，重復性比較差。RNA療法某些靶蛋白表達與臨床治療效果相關聯，可作為替代生物標志物，建立量效關系。要求靶蛋白分析檢測標準需要提高，要求技術需要經過嚴格驗證，Digital Western可滿足這些需求;

 

4) 符合RNA療法對自動化標準化和效率的需求，面對行業激烈競爭，需要提升研發效率。Digital Western實現了全自動化和標準化，軟件符合FDA 21 CFR Part 11合規性需求。系統3個小時完成一批次蛋白質分析，比傳統Western Blot和ELISA更快，大大提高了實驗效率，同時減少人力成本。

 

Jess全自動數字化蛋白質表達定量分析系統 (Digital Western) 是Bio-Techne集團旗下蛋白質分析品牌ProteinSimple所有。系統利用毛細管電泳免疫學分析技術，可從微量樣品中自動吸取、分離、捕獲蛋白質，并通過化學發光或熒光檢測目的蛋白含量。Digital WB自動化程度高，重復性好，靈敏度高和具有較寬動態檢測范圍，這些特點滿足基因治療項目不同階段的目的蛋白定量需求。

 

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