Introduction

樣品制備過程中的蛋白損失是生物學、生物技術和生物制藥領域獲得可靠定量結果的障礙。但在工藝開發或監視過程中進行分析就需要將此類損失保持在最低水平，以便獲得可靠的結果。通過選擇適當的濾膜，可在樣品制備過程中，在廣泛的條件內實現很小的產品損失。
 
 
引言

生物藥樣品通常由含有細胞碎片或蛋白質聚體等不溶性顆粒的原料制成，因此在分析之前需要進行固液分離以保護分析儀器。由于離心分離需要固相和液相之間存在密度差異，所以最好的方式是進行樣品過濾，讓膜過濾器提供絕對的顆粒截留。但是濾膜會吸附蛋白質等分析物，從而影響后續分析的結果。因此，選擇具有最小蛋白質吸附的濾膜至關重要。吸附不僅取決于膜類型，還受到pH和表面電荷等樣品和蛋白質特性，以及特定處理步驟的影響。我們選擇了四種典型的針頭濾器，并在各種樣品條件下，測定了包含兩種不同抗體在內的四種模型蛋白質的回收率，以滿足眾多生物、生物技術和生物制藥應用的要求。
 
 
材料和方法

使用四種模型蛋白質研究濾膜的蛋白質吸附（表1）。


表1

建立了具有 120 個測試的裂區實驗 | 最優設計，其中包含四個數值和兩個分類因素（表2）；通過混合線性二次模型研究針頭濾器不同膜的蛋白質吸附性。
 

表2
  
 
結果與討論

統計實驗設計（DoE）用于測定四種模型蛋白結合情況與四種不同類型針頭濾器濾膜（均具有0.2 μm的孔徑）的結合，通常用于樣品制備，例如工藝過程中控制。醋酸纖維素（CA）膜（Minisart®，表3）的最高蛋白質回收率 > 98 %，并未顯著高于于聚醚砜（PES）膜（Minisart® High Flow）的平均回收率（雙側t檢驗具有 0.05 的顯著性水平）。此外，與尼龍和聚偏二氟乙烯膜相比，兩種膜均顯示出低 3 至 8 倍的標準偏差，這表明：即使對于不同的樣品條件和靶蛋白質，這些膜也能實現高回收率（表2）。
 

表3  0.2 μm孔徑過濾器的特性以及過濾后與膜類型相關的平均蛋白質回收率。

在分析 DoE 時，樣品量，尤其是蛋白質濃度對蛋白質回收率的影響最大，且隨著濃度和體積的增加而增加（圖1）。在這一模型中，給定的表面將結合一定數量的蛋白質，因此（相對）回收率隨樣品量和濃度的增加而增加。因此，大體積和高濃度可以減少使用針頭濾器進行樣品制備過程中產品損失的百分比。


圖1 使用基于膜的針頭濾器的平均蛋白質回收率。在電導率為 32.5mS cm-1，pH 為 6.5 條件下，使用醋酸纖維素（A）、聚醚砜（B）、尼龍（C）和聚偏二氟乙烯（D）膜，對蛋白質 RFP、mAb1、mAb2 和 RuBisCO 的回收率進行平均。

膜類型也會產生相關影響，與尼龍或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜相比，由CA或PES制成的膜表現出明顯更少的蛋白質吸附（回收率 > 95 %），尤其適用于低濃度和樣品量（PVDF）制成的膜相比（回收率 < 75 %）（圖1）。因此，如果靶蛋白稀缺，由CA或PES構成的膜可以幫助降低樣品制備過程中的產品損失。pH效應很大程度上取決于蛋白質。
 
 
結論

大多數樣品處理或制備都會導致產品損失，但是通過選擇適當的濾膜，可在樣品制備過程中，在廣泛的條件內實現很小的產品損失。例如，使用Minisart® NML（CA）或 Minisart® High Flow（PES）濾膜可回收約 90 %的產品。還可以通過微調單個產品的樣品條件來進一步提高產品回收率，例如選擇適當的 pH 值。相比之下，如果蛋白質結合有利于樣品制備，則可以使用尼龍膜，例如Minisart® NY。

Minisart® 針頭濾器


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本篇《如何提高關鍵蛋白質樣品的回收率》應用說明比較了樣品制備過程中比較常用的4種不同膜材質的針頭濾器，說明能夠在樣品制備過程中顯著降低分析物損失的條件和膜類型。


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