圖1. 組織模擬假體示意圖，顯示熒光毛細(xì)管可放入的位置。

②毛細(xì)管：

③熒光染料：

吲哚菁綠（ICG），一種水溶性的、已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)可應(yīng)用于臨床的近紅外熒光染料。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（1）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：

利用組織模擬假體，分別在IVIS Spectrum CT和InSyTe FLECT/CT設(shè)備上對(duì)稀釋后的ICG溶液進(jìn)行成像，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品處于不同位置時(shí)的信號(hào)結(jié)果比較：

使用IVIS SpectrumCT上的相機(jī)采集處于不同角度和方位的樣品圖像，用于評(píng)估信號(hào)采集方向的差異對(duì)最終重建圖像的影響。

同樣地，在InSyTe FLECT/CT設(shè)備中，對(duì)同樣處于模體P2孔腔的、含有2.5 μM ICG染料的毛細(xì)玻璃管進(jìn)行掃描。對(duì)二者的重建圖像進(jìn)行比較。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）使用IVIS Spectrum CT和InSyTe FLECT/CT設(shè)備分別構(gòu)建得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2所示，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘線性回歸分析。利用InSyTe FLECT/CT設(shè)備獲取的結(jié)果呈現(xiàn)幾乎完美的線性（R2 = 0.99），表明熒光強(qiáng)度隨著染料濃度的增加而相應(yīng)增加。而利用IVIS SpectrumCT設(shè)備獲取的結(jié)果雖然也是線性的（R2 = 0.85），但線性擬合程度不及InSyTe FLECT/CT。（由于10μM的染料濃度較高，熒光發(fā)生自猝滅，其檢測(cè)結(jié)果未納入這兩種設(shè)備的線性回歸分析中。）

圖2. 分別使用InSyTe FLECT/CT（上）和IVIS Spectrum CT（下）設(shè)備對(duì)連續(xù)稀釋的ICG染料進(jìn)行熒光成像，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析。

（2）模體相對(duì)于兩種成像設(shè)備上探測(cè)器/相機(jī)的位置如圖3所示。由示意圖可以看出，InSyTe FLECT/CT設(shè)備在數(shù)據(jù)采集的過(guò)程中，使用了可以始終圍繞樣品旋轉(zhuǎn)的探測(cè)器機(jī)架，這種非定向的測(cè)量方式，使得對(duì)于樣品信號(hào)的檢測(cè)可以不受樣品所處方位的影響。而在IVIS SpectrumCT設(shè)備中，相機(jī)處于固定位置，因此在測(cè)量時(shí)，樣品所處的位置對(duì)于檢測(cè)結(jié)果將變得非常敏感。

圖3. InSyTe FLECT/CT（左）與IVIS Spectrum CT（右）在數(shù)據(jù)采集方式上的對(duì)比。

圖4顯示了在不同角度和方位獲取的樣品信號(hào)結(jié)果之間的比較，分別使用之前已構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)曲線、根據(jù)測(cè)定的熒光信號(hào)來(lái)計(jì)算染料的濃度，并與真實(shí)的染料濃度（2.5 μM）做比較。

由結(jié)果可以看出，InSyTe FLECT/CT獲取的信號(hào)強(qiáng)度不受樣品所處位置的影響，檢測(cè)到的熒光信號(hào)始終是穩(wěn)定的，據(jù)此計(jì)算得到的染料濃度（2.2 μM）十分接近真實(shí)的染料濃度。而IVIS Spectrum CT檢測(cè)到的熒光信號(hào)受樣品所處不同位置的影響較大，不同位置計(jì)算得到的染料濃度有較大差異。

圖4. 根據(jù)InSyTe FLECT/CT（上）與IVIS Spectrum CT（下）在不同位置獲取的熒光信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算得到染料的濃度。

五、討論與分析

      從構(gòu)建得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果來(lái)看，IVIS SpectrumCT與InSyTe FLECT/CT設(shè)備在精確重建三維熒光數(shù)據(jù)的能力方面存在顯著差距。FLECT/CT的成像結(jié)果與模體中熒光毛細(xì)管的物理形狀和特征非常一致，也顯示了預(yù)期的來(lái)自毛細(xì)管的漫射熒光。

     相比之下，IVIS Spectrum CT的成像結(jié)果較難解釋，因?yàn)橹亟ê蟮臒晒庑盘?hào)既不出現(xiàn)在預(yù)期的物理位置，其形狀也與模體中實(shí)際的熒光毛細(xì)管不一致。

      對(duì)分別利用InSyTe FLECT/CT和IVIS Spectrum CT采集的信號(hào)構(gòu)建得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量分析顯示，二者的R2值均具有線性。

     其中，InSyTe FLECT/CT的R2值為0.99，具有接近理想狀態(tài)的線性響應(yīng)，而IVIS Spectrum CT的R2值為0.85，也具有線性響應(yīng)。然而，二者之間的線性響應(yīng)還是有一些不同之處的。對(duì)于FLECT/CT獲得的數(shù)據(jù)，系統(tǒng)通過(guò)閾值重構(gòu)熒光體素，在最大值和全寬半最大值（FWHM）之間選擇感興趣區(qū)域（ROI），這種方法考慮到了整個(gè)重建熒光體積上體素值的變化。對(duì)于IVIS Spectrum CT獲得的數(shù)據(jù)，是根據(jù)制造商提供的指南選擇了一個(gè)特定的ROI，該ROI只覆蓋了重構(gòu)熒光的一小部分區(qū)域。這種方法將分析結(jié)果局限于一個(gè)小的ROI內(nèi)，而不是考慮整個(gè)重構(gòu)體的變化。目前尚不清楚，如果選擇了不同的ROI，或?qū)φ麄�(gè)重建體積進(jìn)行分析的話，標(biāo)準(zhǔn)曲線將如何變化。

      樣品處于不同位置時(shí)的信號(hào)測(cè)定結(jié)果顯示，InSyTe FLECT/CT和IVIS SpectrumCT在3D熒光成像性能上的對(duì)比更加明顯。

     InSyTe FLECT/CT成功重建了P2（5mm位置）處的熒光毛細(xì)管，并且，可以根據(jù)測(cè)定的熒光信號(hào)強(qiáng)度，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線正確估計(jì)出染料濃度。由于InSyTe FLECT/CT采用的是可以圍繞樣品旋轉(zhuǎn)的檢測(cè)機(jī)架，因此不受樣品所處的不同方向和位置的影響（即無(wú)方向性，樣品處于任何位置時(shí)的檢測(cè)結(jié)果均一致）。

      IVIS Spectrum CT的成像結(jié)果則顯示出設(shè)備對(duì)于樣本方向的敏感性以及嚴(yán)重的局限性。對(duì)處于3個(gè)方向上的樣品，IVIS Spectrum CT的成像都無(wú)法做到準(zhǔn)確重建，因此也無(wú)法正確計(jì)算得到毛細(xì)管中的熒光染料濃度。這是由于IVIS Spectrum CT在樣品成像區(qū)域的上方設(shè)置了固定位置的探測(cè)器，無(wú)法有效地在360°范圍內(nèi)獲取用于精確重建3D熒光圖像的數(shù)據(jù)導(dǎo)致的。

六、總結(jié)

     三維熒光成像是一種重要的臨床前研究方法，但由于現(xiàn)有儀器設(shè)備的限制，尚未得到充分應(yīng)用。

     InSyTe FLECT/CT，作為一款專門(mén)設(shè)計(jì)用于實(shí)現(xiàn)深部組織成像的臨床前成像儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的3D熒光成像和定量分析功能，恰如本技術(shù)白皮書(shū)中演示的結(jié)果。

     3D可視化技術(shù)提供了進(jìn)一步定量分析的機(jī)會(huì)，如對(duì)腫瘤大小和體積的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，測(cè)定治療藥物的分布和濃度，以及用于觀測(cè)其他的生物現(xiàn)象。

      InSyTe FLECT/CT所使用的 3D熒光成像，可以作為一種補(bǔ)充的技術(shù)手段，填補(bǔ)快速型、2D光學(xué)成像篩查應(yīng)用和基于放射性同位素的3D成像（即PET、SPECT）之間的成像技術(shù)空白，非常適用于臨床前的相關(guān)研究項(xiàng)目。

      另一方面，根據(jù)中南大學(xué)曾文彬教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表的“NIR-I Dye-Based Probe: A New Window for Bimodal Tumor Theranostics”文章中的觀點(diǎn)，近紅外（NIR）成像已成為腫瘤診斷的有力方法，而將NIR熒光成像與其他成像方式進(jìn)行結(jié)合的雙模態(tài)成像，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的協(xié)同成像效果，在疾病的診斷治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。

      基于這種多模態(tài)成像的設(shè)計(jì)理念，除3D熒光成像的功能之外，InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)還配備了強(qiáng)大的CT功能，利用CT所具有的空間分辨率高、解剖信息準(zhǔn)確、價(jià)格相對(duì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，與NIR 3D熒光成像的高靈敏度實(shí)現(xiàn)成像功能上的高度互補(bǔ)，使檢測(cè)結(jié)果更加接近體內(nèi)真實(shí)情況，同時(shí)滿足研究人員對(duì)精確定位與定量分析的需求。

InSyTe FLECT/CT技術(shù)并非全能，它也有很多不足，例如在成像速度和高通量方面就不是優(yōu)勢(shì)。

但它確是名副其實(shí)的詮釋了3D成像、定量、定位的功能；

迄今為止，它為近紅外一區(qū)成像（活體）提供了相對(duì)完美的解決方案：

它擁有針對(duì)弱光和深層發(fā)光的檢測(cè)能力；

它為納米生物學(xué)、藥物的藥效評(píng)估（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）和靶向藥物的生物學(xué)分布提供了新的檢測(cè)方法；

它是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物影像平臺(tái)的一部分，與生物發(fā)光等技術(shù)一起共同為生命科學(xué)的研究服務(wù)。