Ames試驗建立以來，在全球范圍內應用了近五十年，是評價化合物致突變性的一種經典方法。隨著人們對Ames試驗認同度的不斷提高，Ames試驗已成為遺傳毒理學不可或缺的一個檢測項目，廣泛應用于食品、藥品、化學品、化妝品、農藥、醫療器械、消毒產品、環境等多個領域。IPHASE/匯智和源綜合多年Ames試劑盒研發和技術服務的經驗，將試驗過程和試劑盒使用中的常見問題進行了總結，供大家參考。
第一題    要開展Ames試驗，如何選擇溶媒/賦形劑？

答：不同劑量濃度樣品的制備是開展Ames試驗的前提，制備符合試驗要求的樣品也有一些行業要求需要遵守。第一,溶媒/賦形劑的選擇原則是其不與受試物發生反應，對菌株和S9沒有毒性，沒有誘變性；第二，首選蒸餾水，對于不溶于水的受試物可選擇其它溶媒/賦形劑，若受試物對水不穩定，應選用不含水的有機溶劑或賦形劑；第三，若選用有機溶劑作為溶媒，首選DMSO，也可選其它溶媒，若選用的是不常用的溶媒或賦形劑，應有資料說明其理由，且若選用有機溶劑做為溶媒，每平板最高添加量不超過0.1mL。


第二題    Ames試驗的最高劑量組應如何確定？

答：Ames試驗最高劑量組的確定取決于受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。建議先進行預實驗測定受試樣品的毒性和溶解度，應根據受試樣品對細菌的毒性和在配制的最終混合物種的溶解度確定受試樣品的最高劑量組。可將回變菌落數的減少、背景菌苔體積變小或處理后細菌存活率降低等作為細菌毒性的指征。


第三題     Ames試驗組別如何設置？

答：Ames試驗通常需要包含未處理對照組（自發對照組）、陽性對照組（標準誘變劑對照組）溶媒對照組和樣品劑量組四個組別的試驗。需要注意的是，若溶解樣品使用的溶媒和標準誘變劑使用的溶媒不一致時，還需加做DMSO的對照，且樣品劑量組數量不同領域的要求會存在一定差異，需關注具體參照的標準或導則。


第四題    為什么要在有和沒有代謝活化系統的情況下試驗？

答：代謝活化系統是誘導S9和輔因子的混合溶液。誘導S9本身是經藥物誘導后的動物肝臟的組分，誘導的目的是讓酶活得以放大。加代謝活化系統組評估的是代謝產物的遺傳毒性，而不加代謝活化系統組評估的是原藥的遺傳毒性。對于未知化合物，因不確定是其自身，還是其代謝產物會有遺傳毒性，故需在這兩種情況下同時進行試驗。


第五題    Ames試劑盒可以檢測幾個樣品？

答：Ames試劑盒可完成一個樣品的Ames檢測。Ames試劑盒（5菌版/正式試驗）規格為250皿/盒，可在有和無代謝活化系統、5個菌株、三個平行的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測；Ames試劑盒（2菌版/預實驗）規格為150皿/盒，可在有和無代謝活化系統、2個菌株、三個平行的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的8個劑量組的遺傳毒性檢測；微量波動Ames試劑盒的規格我96孔*16板，可在有和無代謝活化系統、2個菌株、48孔/處理組的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測。


第六題    試劑盒中菌株可不可以傳代培養？

答：不建議對試劑盒中的菌株進行傳代培養。原因主要有以下三點：第一，Ames試劑盒中菌株是以凍存菌液形式提供，可滿足Ames試驗要求，收到貨后無需進行其它處理，可直接用于試驗；第二，因Ames試劑盒中菌株均為營養缺陷型菌株，頻繁處理可能使得其某些特性丟失；第三，Ames試驗對菌株不但有濃度的要求，而且有自發和陽性突變菌落數的要求，國標或指導原則中雖然寫的較為簡單，但真正要達到其要求卻很難。


第七題    Ames試劑盒是否可分多次去使用？

答：Ames試劑盒試劑盒中菌株和S9復合物不建議反復凍融使用，如需分次多次試驗，建議按照菌株分次進行。Ames試劑盒中菌株為營養缺陷型菌株，且以凍存菌液形式提供，反復凍融一方面可能會導致其某些特性丟失，另一方面也會直接導致自發回變數和陽性誘變劑回變數達不到標準或指導原則要求。S9復合物在Ames試驗中是作為代謝活化系統，而發生代謝主要是酶的參與，反復凍融會導致酶活降低，可能會導致試驗結果的假陰性。


第八題    當受試物（如某些抗生素）對細菌有高毒性時是否還需進行Ames試驗？有沒有其它驗證方法？

答：當受試物對細菌有高毒性時，仍應進行Ames試驗，因為致突變性可能出現在較低的、毒性較小的濃度。為了減少具有潛在遺傳毒性的化合物產生假陰性結果的風險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合。任何一項遺傳毒性試驗中的陽性結果并不一定能說明化合物對人類真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。故可以加做其它試驗，如基因突變試驗、染色體畸變試驗。


第九題    在實驗的過程中，可能會因為化合物的溶解性不好，導致無法區分是菌落還是沉淀，該如何處理？

答：常規的要求是平皿中可以有未溶解的化合物，但是沉淀的存在不能影響到菌落計數。若這種情況無法避免，可以培養48h后先進行一次菌落觀察和計數，并繼續培養至72h，若生長則可判定為菌落，也可挑取菌落接種至培養基培養觀察是否生長。


第十題    試驗過程中加S9組比不加S9組菌落數要高，是否正常？

答：這種情況屬正常現象，但即使偏高也會在國標或導則的要求范圍內。可能是因為肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可為會菌提供營養。


十一題    受試物濃度低未檢出遺傳毒性還是本身無遺傳毒性？該如何判斷？

答：一方面，Ames試驗的要求是，若試驗結果為陰性，需進行驗證，即需改變試驗條件進行重復試驗。另一方面，為了減少假陰性結果的風險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合，可補做基因突變、染色體畸變、微核等其它試驗。


十二題    醫療器械：浸提溶劑為什么選擇水？按照標準應該選擇生理鹽水或DMSO。

答：關于醫療器械的浸提屬于樣品前處理的過程，試劑盒中未提供，需自行進行準備。試劑盒適用于多個領域的Ames檢測，具體到每個領域，可能會有一定差異。


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