利用近紅外三維成像技術可視化新型反義寡核苷酸納米復合藥物靶向降壓作用研究

研究背景

研究應激性高血壓形成的遺傳和生理機制，探索預防和治療應激性高血壓的新途徑是醫學亟待解決的科學問題之一。所有的抗高血壓藥物都有一些不良副作用，這些副作用有時會成為藥物使用障礙。
反義寡核苷酸與靶RNA的互補位點結合形成DNA/RNA雙鏈，阻斷RNA功能，使用這些藥物可以最大限度地降低毒副作用。此外，寡核苷酸可以快速定向到任何靶點，而尋找新的小分子藥物可能需要數年時間。
納米粒子為核酸類藥物進入細胞提供高效便捷的遞送系統，俄羅斯科學院西伯利亞分院Asya Levina研究團隊，合成了多種納米復合藥物（Si-ODN），通過不同給藥途徑的降壓作用進行藥效評價，并對其在體內生物分布的動態變化進行活體三維成像；
相關研究成果2022年8月發表在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》。


實驗結果

Si-ODN的合成
研究人員合成了多種納米復合藥物，Si-ODN1、Si-ODN2和Si-ODN3分別含有靶向結合AT1A、ADRB1和ACE1的mRNA反義寡核苷酸，隨機序列寡核苷酸的Si-SCR1、Si-SCR2、Si-SCR3作為對照組(表1)。
表1.反義寡核苷酸序列信息

建立應激敏感性動脈高血壓大鼠模型（ISIAH），通過不同途徑給藥Si-ODN，如腹腔注射、霧化吸入、靜脈注射、口服和心肌注射，第二天尾套法測定收縮壓。

AT1A mRNA靶向Si-ODN1的降壓作用
隨機序列寡核苷酸的Si-SCR1對照組ISIAH大鼠血壓沒有變化，同時心肌注射和口服給藥后血壓也無明顯變化。靜脈注射Si-ODN1后，血壓在第三天下降30mm Hg，并在第四天開始上升(圖1)。
研究人員利用AT1A受體阻斷劑，氯沙坦(臨床藥物)作為降壓作用的比較數據。每天給予氯沙坦(10mg/kg)30天后，ISIAH大鼠血壓從183降至150mm Hg。降壓效果與Si-ODN1相同。然而，大鼠必須每天用氯沙坦治療，而單次注射Si-ODN1藥效能持續數天。

圖 1.靜脈注射靶向AT1A mRNA的Si-ODN1納米復合物后的收縮壓.

ADRB1 mRNA靶向Si-ODN2的降壓作用
腹腔注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2，可使血壓在注射后第一天下降約15mm Hg，降壓作用至少持續5天(圖2a)。靜脈注射Si-ODN2在兩天內血壓下降12mm Hg(圖2b)。大鼠心肌內注射Si-ODN2后第二天血壓急劇下降(約50mmhg)，兩天后血壓又回到了最初水平。

圖2.腹腔注射和靜脈注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2納米復合藥物后的收縮壓
a：腹腔注射;b:靜脈注射

ACE1 mRNA靶向Si-ODN3的降壓作用
研究人員使用Si-ODN3和Si-mODN3兩種納米復合藥物進行靜脈注射給藥，Si-mODN3比Si-ODN3更能顯著降低血壓(治療后一天內血壓分別下降了20和12mm Hg)(圖 3)。兩種納米復合藥物作用時間都比較長,并保持了一周的顯著差異。
已知體內約80%的ACE1是在肺血管內皮中合成的，因此Si-ODN3霧化吸入似乎是有利的。前期實驗證明，吸入后一周血壓逐漸下降，第7天達到最低值。一直到第15天才回到初始水平。單次吸入時，兩周內血壓顯著下降了22mm Hg。
本次實驗中，第一次給藥后的初始血壓水平（200 mm Hg）和最低血壓水平（160 mm Hg）。在第一次吸入后的第5天，血壓升高到180 mm Hg（仍低于初始值200 mm Hg），再次吸入Si-ODN3可使血壓下降至160 mm Hg。血壓值在5天內保持在平均175mm Hg，只有在第10天才開始接近初始值（圖4）。因此，影響ACE1基因表達最有效的方法是周期性地吸入Si~ODN3納米復合藥物。
使用卡托普利作為藥物對照（舌下）也會降低收縮壓（~30mmHg）。然而，當使用反義核苷酸納米復合藥物時，降壓效果可以持續數天，而單次給藥卡托普利的效果僅持續數小時。

圖3.靜脈注射靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3和Si-mODN3納米復合藥物后的收縮壓
光柱：Si-ODN3；暗柱：Si-mODN3
圖4.重復霧化吸入靶向ACE1 mRNA的Si~ODN3納米復合藥物后的收縮壓

Si-ODN生物毒性的初步研究
通過霧化吸入或腹腔注射給藥后，對動物體重、行為和血細胞計數來評價Si-ODN的生物毒性。給藥單劑量(60nmol ODN)和雙倍劑量(120nmol ODN)后第五天，評估在陌生環境中的活動量，恐懼應激（低溫），探索活動(后腿站立，中心區域停留)等實驗。此外，腹腔注射Si-ODN1后，第五天檢測血細胞。
結果表明，單劑量和雙倍劑量的納米復合藥物對大鼠在曠場實驗和血細胞含量中無顯著差異。這表明納米復合材料沒有明顯的毒性，即使劑量增加了兩倍。

表3 腹腔注射Si-SCR1后第5天的體重、血壓和行為特征
表4.腹腔注射Si-SCR1后第5天，ISIAH大鼠的血細胞計數

Si-ODN3-Cy7.5體內生物分布
熒光標記納米復合藥物
       熒光染料NHS-Cy7.5(750nmol)與含反義寡核苷酸ODN3-NH2(100nmol)在水-二甲基亞砜混合物(1:1,100μl)中，在0.1 M Tris-HCl、pH8.3、4℃反應16h，標記寡核苷酸。
       ODN3-Cy7.5用2% LiClO4丙酮中沉淀，然后用丙酮洗滌兩次，溶于50μlH2O中。通過吸光度計算濃度，ODN3-Cy7.5（Amax =788nm)的濃度0.4mM。納米粒子、寡核苷酸和Cy7.5的終濃度分別為240mM、1.6mM和0.8mM。
動物模型
       用8-9周齡SPF雄性SCID小鼠，作為納米復合藥物體內分布的動物模型。一組靜脈注射0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5；另一組霧化吸入0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5，霧化30分鐘；兩組在給藥后0.4、1、3、7和14天進行掃描。為了校正熒光信號，分別將1nmol和0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5溶液分別注射小鼠的兩側股骨肌內，注射后立即進行掃描。三維活體斷層成像 ( FLECT )
       使用InSyTe FLECT/CTTM (TriFoil Imaging，Chatsworth，CA，USA) 熒光/x-射線計算機斷層掃描成像。
       CT參數:管電壓30kV，管電流950μA，曝光時間180ms；采用360°連續旋轉掃描技術，360幀投影；圖像分辨率為25×25×25μm，總掃描時間為8分鐘。
       FLECT參數：使用730nm激發光，853nm濾光片，曝光時間為16ms；360°連續旋轉掃描技術，116幀投影；圖像分辨率為1×1×1mm，總掃描時間為60分鐘。使用TriFoil Imaging軟件(chat-worth，USA)重建圖像。在VivoQuantv3.0軟件(Invicro，USA)中將重建的3D CT和FLECT圖像配準融合，使用VivoQuantv3.0定量。

Si-ODN3-Cy7.5 FLECT/CT成像
       靜脈注射Si-ODN3-Cy7.5，主要在肝臟和腎臟中積累(圖5a和b)。在注射后第一天，熒光累積達到最大值，兩周內逐漸從體內代謝清除(圖5d)。
       霧化吸入Si-ODN3-Cy7.5，熒光主要在胃腸粘膜積聚，原因是吸入了沉積在鼻咽部的物質。在大腦(下丘腦，垂體)中檢測到標記熒光(圖 5c)，吸入后第一天，熒光積累達到最大，隨后逐漸從體內清除。(圖5e)
       在靜脈給藥的情況下，ACE1靶向納米復合藥物在腎臟中的積累，可以作為降低高血壓ISIAH大鼠血壓的決定性因素，因為腎臟是腎素-血管緊張素系統的核心器官。吸入納米復合藥物時血壓下降的原因，也可能是因為在具有腎素-血管緊張素系統的大腦中積累。

圖5 小鼠體內檢測標記熒光結果。
靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3-Cy7.5經眼眶靜脈竇注射(a，b)和吸入(c);腎臟、肝臟(d)和腦(e)中標記熒光的動態變化。
1.眼眶靜脈竇; 2.腎; 3.肝;4.腸;5.鼻咽;6.下丘腦和垂體。

研究結論
研究團隊提出了一個最佳治療ISIAH方案，定期霧化吸入靶向 ACE1 mRNA 的寡核苷酸納米復合藥物，同時這種方法恰好也是臨床上可能使用的優選方法。

小編寄語
       FLECT/CT作為當前真正實現光學360°掃描的活體成像技術，暫時處于全球小動物三維成像檢測設備和定量分析的領導地位，擁有卓越的檢測靈敏度，能夠提供更高質量、更豐富的實驗數據。
       重要的是，通過三維熒光斷層掃描，能夠無創檢測對同一小鼠在不同時間點（0.4、1、3、7和14天），納米復合藥物在腎臟、肝臟和腦中的藥物積累（Si-ODN3-Cy7.5×10^-9，mol），進行絕對定量的動態分析，保證了實驗的連續性，助力納米復合藥物的靶向作用和代謝清除動態變化等研究。

期刊名稱：Journal of Drug Delivery Science and Technology
原文標題：In vivo hypotensive effect of aminosilanol-based nanocomposites bearing antisense oligonucleotides
作者：Asya Levina *，Marina Repkova ,et,al.
發表單位：Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine,Siberian Branch of RAS
發表時間：2022年8月
DOI：https://doi.org/10.1016/j.jddst.2022.103612

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