通過激活KLF2來抑制振蕩剪切應力誘導的內皮炎癥
乳酸激活的GPR81可通過激活KLF2來抑制振蕩剪切應力誘導的內皮炎癥
長期以來，內皮功能障礙和炎癥一直被認為是動脈粥樣硬化發病機制中的最早事件，因此是一個有價值的治療靶點。振蕩剪切應力（OSS）通過觸發信號分子的釋放來激活內皮細胞中的炎癥反應，以響應流量感應受體的機械激活。暴露于高剪切應力和層流區域的內皮細胞通過釋放無數動脈粥樣硬化保護基因（包括Kruppel樣因子2（KLF2））而具有動脈粥樣硬化保護能力。IL-8 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達驅動單核細胞募集到血管系統中的 OSS 區域，其中粘附分子包括血管粘附分子（VCAM）-1 和內皮細胞選擇素（E-selectin）導致單核細胞和白細胞滾動并粘附在內皮上。
KLF2是一種重要的鋅指轉錄因子，對動脈粥樣硬化產生具有保護作用。在層流剪切應力誘導下，KLF2下調VCAM-1和E-選擇素的表達，從而減弱單核細胞與內皮細胞的粘附。然而，KLF2在暴露于OSS的動脈分支和其他區域表達降低，這些區域長期以來一直被認為容易發生動脈粥樣硬化病變。細胞外信號調節激酶5（ERK5）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，也密切參與調節內皮炎癥和動脈粥樣硬化的發生。
最近，G蛋白偶聯受體（GPCRs）家族作為多種疾病的有價值的治療靶點受到重視。在GPCR家族的大約800個成員中，GPR81，也稱為羥基羧酸受體1（HCAR1），是一種選擇性乳酸敏感受體，已知在多種細胞類型中表達，包括腦細胞、脂肪細胞、各種癌細胞和視網膜等。GPR81已被證明在骨髓內皮細胞中高表達，據報道，GPR81介導的乳酸信號通路可調節炎癥反應。
在華中阜外醫院（河南省人民醫院心臟中心）團隊的一項研究中，探索了GPR81介導的乳酸信號通路在OSS誘導的內皮炎癥中的潛在作用。
首先，實驗進行了實時PCR和蛋白質印跡分析，以確定暴露于OSS對HUVECs中GPR81表達的影響。如圖1 所示，持續暴露至 5 dyn/cm2 OSS以時間依賴性方式顯著降低HUVECs中GPR81的表達。在 24 小時時間點下，GPR81 的表達在 mRNA 和蛋白質水平上均降低了 50% 以上。
圖1 暴露于振蕩剪切應力（OSS）抑制了人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中的GPR81。HUVECs用OSS處理（5 dyn/cm2） 8、16 和 24 小時。
（a）實時熒光定量PCR顯示OSS在mRNA水平上降低了GPR81的表達。
（b）蛋白質印跡顯示OSS在蛋白質水平上降低了GPR81的表達。
眾所周知，不同的流動模式在內皮細胞中引發不同的生物反應。經歷OSS的內皮細胞進入促炎狀態，而暴露于生理高剪切力（HSS）的內皮細胞則具有抗炎特性并表達動脈粥樣硬化保護分子。通過將HUVECs暴露于OSS或HSS（15 dyn/cm2）中24小時，實驗進一步研究了OSS和HSS對GPR81表達的調控是否不同。結果表明，HSS在mRNA和蛋白質水平上顯著增加了GPR81的表達，這與OSS的效果相反。這些數據表明，剪切應力具有直接增加或降低GPR81基礎表達水平的能力。
氧化應激是內皮功能障礙過程中的關鍵因素。因此，研究了乳酸（GPR81特異性激動劑）對OSS誘導的氧化應激的影響。如圖2所示，暴露于OSS使線粒體活性氧（ROS）的產生增加到大約四倍。然而，用乳酸處理將ROS的產生降低到僅約1.5倍基線水平，因此表明乳酸具有有效的抗氧化特性。
圖2 用乳酸抑制振蕩剪切應力（OSS）誘導的線粒體ROS生成。HUVECs在存在或不存在7.5、15 mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。線粒體ROS通過用MitoSOX紅染色來測量。
接下來，確定了乳酸介導的激活參與OSS誘導的幾種關鍵炎性細胞因子和趨化因子的表達。結果表明，OSS在mRNA和蛋白質水平上觸發了IL-6、IL-8和MCP-1表達的顯著增加。然而，乳酸的存在導致這些分子的表達顯著降低。同時，乳酸以劑量依賴性方式將OSS誘導的HMGB1表達從約5.2倍降低到僅1.8倍。
為了確定乳酸對OSS誘導的單核細胞與內皮細胞粘附的影響，實驗研究了乳酸對VCAM-1和E-選擇素表達的影響。如圖3所示，實時熒光定量PCR和蛋白質印跡分析的結果表明，OSS分別在mRNA水平，特別是在蛋白質水平上顯著增加了VCAM-1和E-selectin的表達。同時，兩劑乳酸的加入極大地抑制了OSS誘導的這兩種粘附分子的表達。為了確認乳酸的這種潛在的抗單核細胞粘附能力，進行了實驗以確定暴露于OSS時附著在HUVECs上的人白血病細胞單核細胞U937的數量。結果表明，OSS將附著的U937細胞的數量增加到大約3.3倍，通過兩劑乳酸以劑量依賴性方式減少到僅2.1倍和1.5倍。
圖3 用乳酸抑制振蕩剪切應力（OSS）誘導的VCAM-1和E-選擇素表達。
HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2）。（a）通過實時PCR分析確定的VCAM-1和E-選擇素的mRNA水平。（b） 通過蛋白質印跡分析確定的 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質水平。
最后，實驗研究了KLF2和ERK5通路在介導GPR81激活的這些保護作用中的參與。結果表明，暴露于OSS使動脈粥樣硬化保護性轉錄因子KLF2的表達降低了約65%，通過使用乳酸激活GPR81，KLF2在mRNA和蛋白質水平上以劑量依賴性的方式恢復到接近基線水平。
為了確定ERK5通路在GPR81介導的KLF2表達恢復中的參與，首先測量了暴露于OSS和兩劑乳酸時的磷酸化和總ERK5水平。如圖4 a所示，OSS顯著降低了p-ERK5的水平，而乳酸以劑量依賴性方式挽救了p-ERK5的水平。接下來，使用特異性ERK5抑制劑XMD8-92來確認GPR81對KLF2的拯救是通過ERK5介導的。如圖4 b、c所示，抑制ERK5在mRNA和蛋白質水平上消除了乳酸介導的對KLF2表達的恢復，從而表明乳酸介導的GPR81激活對OSS誘導的KLF2表達抑制的保護作用取決于ERK5通路。
圖4 乳酸誘導的KLF2表達由ERK5介導。
（a）HUVECs在存在或不存在7.5、15mM乳酸24小時的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量p-ERK5和總ERK5。（b）HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量KLF2的mRNA水平。（c） HUVECs在存在或不存在15 mM乳酸24小時或特異性ERK5抑制劑XMD8-92（10 nM）的情況下用OSS處理（5 dyn/cm2），測量KLF2的蛋白質水平。
為了進一步證實GPR81參與介導乳酸對HUVECs中OSS誘導的內皮功能障礙的保護作用，用siGPR81轉染細胞。GPR81的成功敲低如圖5 a。重要的是，發現敲低GPR81消除了乳酸對OSS誘導的VCAM-1和E-選擇素表達的抑制作用（圖5 b）。GPR81的沉默也阻止了乳酸對OSS誘導的U937細胞附著于HUVECs的抑制作用（圖5 c）。這些發現表明，乳酸對OSS誘導的HUVECs內皮功能障礙的抑制作用是由GPR81介導的。
圖5 敲低GPR81消除了乳酸對內皮功能障礙的抑制作用。
（a）蛋白質印跡分析顯示GPR81成功敲低。（b）通過蛋白質印跡分析測量VCAM-1和E-選擇素的表達。（c）測定U937細胞與HUVEC的附著。
總之，該研究結果證明了GPR81作為有效的動脈粥樣硬化保護受體的新作用。GPR81在暴露于OSS的血管動脈粥樣硬化易發區域中的特異性激活可以通過抑制內皮炎癥和氧化應激，抑制粘附分子的表達以及上調保護性KLF2轉錄因子的低表達來抑制動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化病變的發展。
參考文獻：Sun Z, Han Y, Song S, Chen T, Han Y, Liu Y. Activation of GPR81 by lactate inhibits oscillatory shear stress-induced endothelial inflammation by activating the expression of KLF2. IUBMB Life. 2019 Dec;71(12):2010-2019. doi: 10.1002/iub.2151. Epub 2019 Aug 24. PMID: 31444899.
