自1956年研究人員首次在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)支原體污染以來，支原體污染問題無處不在。[1]支原體污染非常不易察覺。有的實(shí)驗(yàn)室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效徹底的支原體檢測并清除，該實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無法進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，甚至需要更換細(xì)胞間。綜合FDA、美國模式菌種收集中心（ATCC）等機(jī)構(gòu)收到的相關(guān)數(shù)據(jù)，世界各國細(xì)胞系支原體污染的平均比例為30-60%。[2]一項(xiàng)來自賓夕法尼亞大學(xué)的研究顯示，在NCBI的2012-2013年的GEO項(xiàng)目中，約11％含有支原體污染[3]，支原體污染已經(jīng)成為細(xì)胞培養(yǎng)工作中最顯著的問題之一。
支原體污染細(xì)胞的后果
支原體污染是個循序的過程，因其沒有細(xì)胞壁，普通抗生素對其無效[4]。根據(jù)已發(fā)表的支原體污染研究文獻(xiàn)，支原體污染細(xì)胞后，幾乎能影響每一個細(xì)胞參數(shù)。其可能導(dǎo)致細(xì)胞染色體的異常和損傷，改變細(xì)胞的代謝、生長、形狀、附著，甚至?xí)绊懙交虮磉_(dá)。此外，支原體污染能耗盡營養(yǎng)物，促進(jìn)代謝積累，重度支原體污染還將導(dǎo)致培養(yǎng)基pH改變。
為了全面了解支原體污染情況，來自加州大學(xué)的John Hogenesch教授獲得了九千多份樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，這些樣本來自于2012年-2013年間哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)研究[3]。John在測序數(shù)據(jù)中尋找支原體DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11%的樣本都受到了支原體的污染。
據(jù)John表示，支原體DNA水平最高的一些研究，曾發(fā)表在Cell、Nature和PNAS等頂尖雜志上。雖然支原體污染并不一定意味著這些研究結(jié)果無效，但這種微生物會影響數(shù)百個基因的表達(dá)，并與細(xì)胞競爭營養(yǎng)阻礙細(xì)胞的生長。在其中一組淋巴瘤細(xì)胞受污染的數(shù)據(jù)中，John鑒定出了61個被支原體改變的基因。由此可見，支原體感染能在不知不覺中干擾研究結(jié)果，浪費(fèi)大量的科研資金和寶貴的時(shí)間——John的實(shí)驗(yàn)室曾遇到過一次支原體污染，雖然問題很快得到解決，但仍然浪費(fèi)了大約十萬美元和一年的研究。
在細(xì)胞培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，都容易受到支原體污染，比如操作人員的疏忽、培養(yǎng)基更換時(shí)操作不規(guī)范、細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室間流通時(shí)缺乏質(zhì)控等，由于細(xì)胞受到支原體污染時(shí)形態(tài)不易發(fā)生變化，因此很難通過簡單觀察辨別細(xì)胞是否收到了污染，等到發(fā)現(xiàn)細(xì)胞感染了支原體時(shí)，已經(jīng)為時(shí)已晚。
支原體檢測方法對比
最近十年里，有兩種經(jīng)典的方法被用于常規(guī)支原體檢測，它們的靈敏度和可靠性已經(jīng)獲得了證實(shí)：培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法。在過去幾年里，支原體檢測對速度快、靈敏度高且穩(wěn)健性高的需求日益增加。
在分子檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法一直是微生物檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，迄今為止，全球范圍內(nèi)仍將它作為支原體常規(guī)檢測方案。不同于培養(yǎng)法，指示細(xì)胞培養(yǎng)方法通過對培養(yǎng)物的DNA染色來判斷是否存在支原體生長。可用于某些“挑剔”的支原體檢測，因?yàn)檫@些支原體不能在用于培養(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長。
除了以上兩種藥典認(rèn)證的方法外，目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法還有DNA熒光染色法、PCR擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法等。通常需要一種操作簡單，耗時(shí)較短，靈敏度較高，結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確的方法以應(yīng)對日常檢測的需求，其中PCR擴(kuò)增技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法以耗時(shí)短見長，而DNA熒光染色法和生長抑制試驗(yàn)因操作簡單受到青睞，以下是各種方法的優(yōu)勢對比。
幾種檢測方法對比，部分?jǐn)?shù)據(jù)來源參考文獻(xiàn)5
一般來說，新的細(xì)胞株都需要做支原體檢測，細(xì)胞培養(yǎng)期間，建議每1-2周進(jìn)行一次支原體檢測以防止污染。以上列舉的檢測支原體方法各有優(yōu)勢，但是即便通常被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”的培養(yǎng)法，也可能會漏掉某些需要特殊培養(yǎng)條件的“精挑細(xì)選”的支原體。因此，在實(shí)驗(yàn)室的日常研究需求中，需要一種快速、全面的檢測方法以應(yīng)對日常的檢測需求。
Lonza MycoAlertTM
簡便易行的支原體快檢
Lonza MycoAlert™支原體檢測試劑盒主要有兩大優(yōu)勢：1）操作簡單；2）檢測時(shí)間短。
其通過檢測在支原體和其柔膜細(xì)菌中存在的乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性，完成支原體檢測。僅需兩步簡單操作，20分鐘即可完成檢測。這兩種酶在導(dǎo)致95%支原體污染的6個種屬和大多數(shù)的柔膜細(xì)菌中均存在，但在真核細(xì)胞中不存在，此法既可保證檢測的準(zhǔn)確性，又可快速完成檢測。
檢測原理
檢測流程和結(jié)果判定
此外，該試劑盒的檢測范圍包括所有常規(guī)的支原體和甾原體，適用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的檢測與篩選。其對設(shè)備要求低的特性適合搭配大部分可以檢測luminescence模式的多功能酶標(biāo)儀，且可搭配lucetta 2光度計(jì)進(jìn)行MycoAlert檢測的特定模式和基于luciferase的相關(guān)試驗(yàn)檢測。此外，lucetta 2光度計(jì)無需PC，體積小便于移動，可適用于實(shí)驗(yàn)室間移動檢測。
Lonza MycoAlert™支原體檢測試劑盒除細(xì)胞培養(yǎng)上清外，還可以檢測血清，未使用過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基補(bǔ)充物等。此外其操作簡單、檢測迅速、通用性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，已幫助很多實(shí)驗(yàn)室建立了細(xì)胞株監(jiān)測體系以預(yù)防支原體污染，值得一提的是，Lonza MycoZap™支原體去除試劑，通過抗生素與抗代謝試劑聯(lián)用可有效去除支原體，確保研究可靠。
小結(jié)
支原體污染是生物制品外源因子污染檢查的經(jīng)典話題，生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體、基因治療產(chǎn)品在研發(fā)過程的不同階段都需要進(jìn)行支原體檢測。此外，幾乎涉及到細(xì)胞培養(yǎng)的研究也都需要防范支原體的污染，目前尚無一勞永逸地預(yù)防手段，這就要求在研發(fā)過程的各個環(huán)節(jié)中需要嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，且由于支原體的隱蔽性較強(qiáng)，增加檢測次數(shù)是性價(jià)比較高的預(yù)防手段。
來源：醫(yī)麥客
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