細胞活性分析

與增殖測定

 

小編前陣子去學了CPR，第一個步驟就是要先確認倒在那里的人是不是還…活著。
先生先生，你怎么了？（拍拍肩膀）
讓小編開始好奇，我的細胞“要怎么判斷他們是死是活呢？它們活的好嗎?”

 

 

我們可以簡單將分析細胞活力和增殖測定的方法分成5大類：

1. DNA合成增殖試驗

2. 代謝增殖測定

3. 化學發光細胞活性測定

4. 熒光染料增殖試驗

5. 臺盼藍細胞計數

以下簡單介紹這些分類的幾種常見實驗方式吧！

 

 

01

 DNA合成增殖試驗 

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 BrdU檢測法 

BrdU結構長的跟胸腺嘧啶核苷（Thymine）很像，當細胞生長通過增殖周期-S期（DNA半保留復制期）時，BrdU可魚目混珠進入新合成的DNA中，因此在加入BrdU后分裂增殖的細胞都會帶有含BrdU的DNA，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，統計S期細胞百分數并計算細胞倍增時間；但BrdU單克隆抗體太大，無法直接與DNA雙股螺旋上的BrdU結合（胖子上不了螺旋樓梯），所以實驗過程需要將DNA部份變性，使雙股部份解開成單股才能順利檢測，實驗步驟較繁瑣復雜。

 

 

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 EdU 檢測法 

EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶滲入正在復制的DNA中；但能與EdU共軛反應的染料分子僅為BrdU抗體的1/500,在細胞內更容易擴散，所以不需要變性處理，有效縮減實驗操作時間，更能避免樣品損傷，反應更真實的細胞增殖狀況。

 

偵測方法：ICC、IHC、FACS、ELISA

 

 

 

02

 代謝增殖測定 

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 MTT檢測法 

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶,能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶,并沉積在細胞中，死細胞則無現象；再利用二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT藍紫色結晶（Formazan），即可利用酶標儀測定光吸收值，并計算出活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT藍紫色結晶形成的量與細胞數成正比。

 

 

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 XTT檢測法 

與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應，并利用酶標儀測定產物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT反應產物為水溶性橙黃色物，不需經過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值，操作較MTT方便快速。

 

 

 

03

 化學發光細胞活性測定 

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 ATP發光法 

原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細胞內含的ATP為能量來源，發生氧化反應產生生物冷光；而ATP是活細胞的必含物質，在細胞內含量恒定，因此可通過監測冷光光度，來對應ATP含量并判斷細胞增殖狀況。

 

 

 

04

 熒光染料增殖試驗 

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 CFSE檢測法 

CFSE是一種可穿透細胞膜的熒光染料，不具有熒光性質，而具有細胞膜通透性，能夠自由進入細胞；當CFSE擴散穿過細胞膜，會與細胞內酯酶產生水解反應而發出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進一步與細胞骨架蛋白結合，形成穩定的胞內熒光蛋白。每當細胞進行分裂增殖，胞內熒光蛋白會被平均分配到下一代細胞中，因此細胞熒光強度會隨著增殖代數增加而不斷的降低，可用流式細胞儀進一步偵測分析得出細胞分裂增殖的情況。

 

 

 

05

 臺盼藍細胞計數 

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 臺盼藍（Trypan Blue）計數法 

臺盼藍是一種藍色染料，無法通過結構完整的細胞膜進入細胞內部；但細胞死后，喪失細胞膜穩定性，臺盼藍會進入細胞將細胞染成藍色，因此在細胞實驗中，被常規的搭配自動細胞計數儀或血球計數板應用于區分活細胞和死細胞。

 

 

 

當然，科技日新月異，
有越來越多更精確的實驗方法等著大家去學習研究。
您實驗室都在用什么方法測定細胞活性呢?