分批補料微型生物反應器設計的最新進展

瀏覽次數：2136　發布日期：2022-9-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

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01/介紹

02/內部補料策略

1.擴散控制補料

2.酶控補料

3.內部補料策略小結

03/外部補料策略

1.自動化液體處理系統

2.用于分批補料微生物反應器系統的微流體和微型閥技術

3.外部補料策略小結

04/結論

前言

先進的分批補料微生物反應器可降低擴大規模的風險，并更接近模擬工業培養實踐。近年來，已經開發了高通量微量補料策略，無論實驗預算如何，都可以提高微量分批補料培養的可及性。該綜述探討了這些技術及其在加速生物過程開發中的作用。擴散和酶控制的補料可實現基質的連續供應，且簡單實惠。更復雜的補料曲線和更強的過程控制需要額外的硬件。自動液體處理機器人可被編程為預定義的補料曲線，并具有響應過程參數偏差的靈敏度。

研究顯示，微流體技術可促進連續和精確補料。將自動化高通量分批補料培養與實驗設計和基于模型的優化相結合的整體方法極大地增強了過程理解，同時最大限度地減少了實驗負擔。為在線優化補料條件引入實時數據可進一步細化篩選。盡管該綜述中討論的技術有望實現高效、低風險的生物過程開發，但自動化培養平臺的費用和復雜性限制了其廣泛應用。未來的關注點應該集中在開源軟件的開發上，減少硬件的排他性。

01介紹

許多公司依賴于不可再生的石化原料以及更復雜工藝的天然產品所需的大量步驟可能會阻礙經濟可行性，將可再生原料生物轉化為此類天然產物的微生物細胞工廠的建設，引起了人們的極大興趣。

生物工藝開發的初始階段涉及廣泛篩選各種菌株和工藝參數。使用簡單的批量微量滴定板(MTP)或搖瓶培養在此階段仍然很普遍，這主要是由于與實驗室規模的攪拌反應器相比，它們的成本相對較低且通量較高。然而，由于體積小和缺乏用于在線監測和控制基礎設施，分析通常限于端點分析，限制了過程洞察力。

在這種情況下，先進的微型生物反應器MBR 系統越來越多地被采用，其目的是克服這些關鍵的瓶頸。使用新的混合策略，盡管空間和資源要求顯著降低，但仍有可能有效模擬較大的實驗室生物反應器。許多裝置可以并行運行，便于高通量篩選應用。通過將 MBR 技術與戰實驗設計(DoE)方法相結合，可以進一步最大化過程洞察力，同時最小化實驗負擔。DoE 促進了對生物系統中無處不在的因素相互作用的系統評估，以及對設計空間的更廣泛探索。為確保工業規模的最佳性能，應在生物過程開發的早期階段應用 DoE 同時優化遺傳和環境。

微規模培養和工業規模培養之間的培養策略的主要不一致性可導致在生物過程開發的最早階段選擇次優菌株和過程條件。因此，必須將過程控制策略和分批補料操作納入高通量篩選，以確保更接近地模擬工業規模的培養條件。

最近開發了幾種具有內置補料、控制和采樣能力的新型 MBR，以克服這一關鍵瓶頸。已經研究了創新的內部和外部補料策略及其模仿不同常用工業補料策略的潛力，例如脈沖、指數、修正指數和線性補料。內部分批補料策略包括擴散和酶控制的補料，通常涉及由半透膜分開的雙相培養基和多糖基質的生物催化分解。通過使用微流體和自動化液體處理系統(LHSs)。這種系統提供了改進的補料控制，允許更有效地模仿工業相關的脈沖、線性和指數進給策略。引入基于模型的優化算法以實時分析過程數據并重新確定最佳培養策略也獲得了極大的興趣，以進一步加快生物過程開發。

將新型分批補料 MBR 與統計 DoE 和基于模型的優化策略相結合的整體方法可能是穩健菌株開發和優化的最佳方法。通過對大量遺傳和環境因素組合進行戰略性高通量篩選，可以確保設計質量，同時監測和控制工業相關工藝參數。與傳統方法相比，這種增加的過程洞察力有可能通過減少所需的篩選階段的數量來大大加快生物過程的開發。

02 內部補料策略

在內部分批補料系統中，基質在培養容器內逐漸釋放，無需外部補料。這些系統的主要特點是它們與現有基礎設施的兼容性。由于不需要先進的微型泵、微流體或液體處理機器人技術，因此可以顯著降低成本和復雜性。這種系統通常利用擴散或催化現象。

2.1擴散控制補料

擴散控制進料涉及將截留的營養物從聚合物吸附劑或通過人工膜緩慢釋放。培養基中的營養物質擴散穿過半透性透析膜，然后被細胞利用。Philip 等人 2017年闡明了作為影響補料速率的關鍵因素的兩個參數，儲器中的初始基質濃度和膜幾何形狀。這有助于更好的補料速率控制，并且發現盡管培養體積放大了 100 倍。然而，使用透析膜的擴散控制補料方法的一個主要限制是其對搖瓶培養的限制，這限制了生產量。

Jeude等人2006 年開發了 FeedBead®技術，這項技術最初也是為了在搖瓶中使用而開發的，但 Scheidle 等人 2009 年證明了 FeedBead®技術適用于 MTP 應用。Keil 等人于 2019 年開發了一種 MTP FeedPlate®系統，該系統在每個孔的底部包含一個固定的固體有機硅基質和嵌入的葡萄糖晶體。在這些 FeedPlates®中，GFP 產量提高了 245 倍。該板以 24、48 或 96 孔形式上市，允許以分批補料模式直接進行高通量培養。然而，培養基 pH、溫度和滲透壓等外部因素對葡萄糖釋放速率有主要影響。因此，使用該技術時，對基質釋放速率的精確控制受到限制。

2016 年，Flitsch 等人研發了一種改進的 μ-RAMOS 設備，其目的是克服原始設備的瓶頸。更新后的系統在 48 孔 MTP 的每個孔中配備了氣體入口和出口閥以及光學傳感器，便于對所有 48 種培養物同時進行 OTR 監測。該技術最近被進一步擴展用于 96 孔深孔 MTP，使研究人員能夠實現比原始搖瓶規模的RAMOS 系統增加 15 倍的實驗通量。Habicher 等人 2020 年證明了最先進的 μ- RAMOS 和 FeedPlate®對于工程化用于蛋白酶生產的地衣芽孢桿菌菌株的葡萄糖限制培養的兼容性。OTR 的在線監測極大地改善了 MTP 培養物的信息含量，發現其在 MTP 和搖瓶規模下的性能相當。使用該平臺生成的數據可用于在開發的最早階段生成數學模型，從而根據設計原則顯著改善了過程質量。

Wilming 等人 2014 年使用 96 孔 MTP 開發了一種替代的基于擴散的分批補料系統。每個培養孔通過填充有聚丙烯酰胺水凝膠的擴散通道連接至儲層孔，便于每個平板進行多達 44 次平行分批補料培養。用濃縮基質溶液填充儲器，以實現逐步擴散驅動補料。通過改變儲器中的濃度并由此改變驅動濃度梯度。然而，發現補料濃度和葡萄糖釋放速率之間的關系是非線性的。這種使補料速率微調復雜化的非線性歸因于水的反向擴散。盡管如此，板的透明底座提供了與板讀取技術兼容的主要優勢，例如用于通過散射光測量生物量和熒光的 BioLector 系統(mp2-Labs，德國)。使用該系統證明了大腸桿菌和多形嗜血桿菌菌株的分批補料培養。與分批對照相比，用最佳 300g/L 葡萄糖補料進行大腸桿菌的分批補料培養分別導致生物量和基于黃素單核苷酸的熒光報告蛋白信號增加約5 倍和14 倍。

2.2酶控補料

淀粉在液體培養基中的溶解度差，需要在原始 EnBase®工藝中使用固相。為了消除對雙相系統的需求，開發了具有完全可溶性聚合物基材的 EnBase® Flo。葡萄糖釋放方法與礦物鹽和復雜培養基添加劑的精心優化組合相結合，以產生高細胞密度和產品滴度。Glazyrina 等人 2012 年通過在 3mL 至 60L 的范圍內培養經工程改造過量生產模型酶醇脫氫酶的大腸桿菌菌株，研究了 EnBase® Flo 系統的可擴展性。在所有測試規模下均實現了相當的增長率和蛋白質滴度，突出了可擴展性。在所有測試規模上都實現了可比的生長速率和蛋白質滴度，突出了可擴展性。EnBase®系統還提供了在大型生物反應器的初始培養階段控制葡萄糖釋放的額外好處，完全消除了溢出代謝。

EnBase®技術還以方便的片劑形式在市場上銷售。該 EnPresso®系統與 D- optimal DoE 方法相結合，可優化 24 孔板中工程大腸桿菌的纈諾霉素生產。與原始分批培養相比，DoE 驅動的平行分批補料培養策略使纈氨霉素滴度提高了 33 倍。

2.3內部補料策略小結

擴散和酶控制的補料策略提供了一種相對簡單和低成本的方法來模擬更大規模的分批補料過程。它們提供了恒定基質補料的關鍵優勢，但在整個培養過程中通常不可能精確控制補料速率。結果，更復雜(例如指數)的進給曲線不能使用內部補料策略。此外，補料通常限于單一基質，這可能導致培養基中的其他營養物變得有限。特別是基于酶的補料依賴葡萄糖作為碳源，這可能不是所有過程的最佳選擇。此外，在此類系統中，酸和堿補料通常是不可能的，從而限制了過程控制能力。

03 外部分批補料策略

在外部分批補料系統中，基質從外部儲器補料。該策略的主要優點是增加了靈活性和過程控制能力。然而，由于補料需要額外的基礎設施，外部分批補料系統固有地更復雜且操作成本更高。

3.1自動化液體處理系統

使用液體處理工作站可以實現高通量采樣以及向 MTP 或平行 MBR 中添加液體。例如，RoboLector®包括集成的 BioLector®（mp2-Labs，德國）MBR 篩選平臺。自動取樣編程為每 24 小時一次。補料和取樣均在不中斷搖動的情況下實現，從而最大限度地減少對氧氣傳輸的干擾并防止細胞沉降，從而允許獲得代表性的樣品。

與脈沖補料策略相關的關鍵挑戰是缺乏連續的補料供應，這導致細胞代謝中的振蕩并限制與工業規模發酵的可比性，在工業規模發酵中，指數補料策略更常用。Jansen 等人于 2019 年開發了一種自動反饋調節的基于酶的分批補料系統(FeedER)。可以通過控制添加來實現定義的指數生長速率。

Ambr®平臺通過添加泵送液體管線，可以向每個單獨的反應器中連續添加液體。克服了間歇補料的局限性，有利于實施連續補料方案和更嚴格的 pH 控制。

Bioreactor48 平臺（2mag，德國）與Freedom EVO(TECAN，瑞士) LHS 相結合，以實現分批補料和過程控制。Bioreactor通過 LHS 向含有 β-呋喃果糖苷酶的培養物間歇投加蔗糖，使可代謝的果糖和葡萄糖得以連續釋放。對間歇葡萄糖和酶促攝食策略的比較表明，生物量累積非常相似，但是，連續(酶促)攝食增強了 GFP 熒光。DO 振蕩在間歇補料培養物中顯著更大。

3.2 用于分批補料微生物反應器系統的微流體和微型閥技術

與自動 LHS相關的一個關鍵挑戰是補料的間歇性。近來，微流體技術已經被實施，其目的在于開發更精確的工業過程的按比例縮小模型。微流控生物反應器系統涉及對小體積流體的受控操作。

在 Mardanpour 和 Yaghmae 研究中，使用大腸桿菌作為生物催化劑，在微流控微生物燃料電池(MFC)中以分批補料模式從葡萄糖和尿素產生生物電。為了構建微流控 MFC，使用具有單個微通道的聚甲基丙烯酸甲酯板作為主體，使用鎳基陽極和負載鉑的碳覆蓋陰極作為主體頂部和底部的電極，通過這種方式，親水性鎳表面吸收陽極電解液并促進細胞附著，從而促進生物膜的生長。

為了確定最適合再現大型生物反應器波動條件的微流體系統，Ho 等人比較了三種廣泛使用的微流體設計。該研究表明，微流體系統的設備設計在定量和靈敏地再現典型工業規模生物反應器中的不均勻性方面起著關鍵作用，可能會影響分批補料系統的工藝產率。

微流控FlowerPlate 技術最近被用于優化谷氨酸棒桿菌的綠色熒光蛋白(GFP) 生產。Morschett 等人開發了一種高通量、并行化的 pH 控制分批補料培養工作流程，可在線監測微孔板中的生物量、pH 值、DO 和熒光。每排的兩個容器中分別加入葡萄糖-尿素補料溶液和 3M 磷酸(單側 pH 控制)。將具有不同補料策略(脈沖、恒定、指數)的分批補料工藝與標準分批工藝進行了比較。

商業微基質(Applikon Biotechnology，荷蘭)平臺是一種接近連續補料的替代方法，這種方法便于通過微型閥對每種單獨的 μBR 進行獨立的液體添加。該最先進系統基于標準 24 孔深孔板，工作體積為 2–7mL，具有集成的熒光團 pH 和溶解氧傳感器，以及每個單獨孔的獨立氣體和液體添加量。

3.3 外部補料策略總結

具有自動外部補料和嚴格控制工藝參數的新型 MBR 技術的最新進展，使得能夠更接近地模擬工業規模的生物過程。通過自動化，實驗的吞吐量和精確度得到了顯著的提高。機器人 LHS 已證明了在微尺度下有效高通量分批補料培養的潛力。它們可以與現有硬件相結合，并易于編程，以實現廣泛的實驗應用。通過安裝液體處理機器人和分析設備，對 Bioreactor 培養平臺進行了改造，實現了全自動受控分批補料培養，并具有自動取樣和在線樣本分析功能。Mühlmann 等人的一項研究也證明了 RoboLector®平臺的適應性，為了實現自動補料培養基制備和細胞培養，安裝了額外的冷卻器、加熱器搖動器和真空站。移液操作可以預先編程以執行定義的補料配置文件并以高精度重復多次。LHS 補料的另一個限制是它的間歇性。微流體設備提供連續的補料供應，以更接近地代表工業規模條件。可以使用微流體裝置分配小體積，使得它們對單個細胞的研究特別有吸引力。由于對分離細胞的研究允許將細胞內效應與細胞間或群體效應區分開來，因此這可能有利于菌株的發育。

具有外部補料和無創在線監測的自動化并行MBR 平臺允許在相對短的時間內生成大量高質量數據集。然而，由于高設備成本和廣泛的編程要求，投資比更簡單的內部系統要大得多。

04 結論

在過去的十年中，微量高通量分批補料培養技術取得了長足的進步。已經開發了各種復雜性和硬件要求不同的補料機制，使得流式分批培養越來越容易獲得。由于與傳統的分批培養系統相比，分批補料系統可以更接近地模擬工業規模條件，因此它們可以最大限度地降低與生物工藝規模相關的風險。

盡管成本相對較低且易于實施，在整個培養過程中不可能進行精確的補料速率控制，并且補料通常僅限于單一基質。通過引入外部硬件，可以實現更復雜的補料分布和過程參數(如 pH)控制。自動液體處理機器人可被編程為響應于過程參數與指定設定點的偏差或根據預定義的補料曲線執行液體添加。最近，自動化液體處理機器人的可負擔性有了顯著提高，然而，為確保其廣泛應用，有必要開發標準化操作程序和直觀的軟件，以便于其簡單操作。盡管它們的高精度和靈活性很有優勢，因為補料是通過間歇推注進行的，但無法實現工業相關的連續補料曲線。然而，這可以很容易地通過耦合 LHS 和酶控制的補料策略來解決。微流體技術也被開發出來，以便于非常小體積的連續精確補料。

通過將自動化的高通量分批補料培養平臺與實驗的戰略設計和基于模型的優化策略相結合，可以顯著增強對過程的理解，同時最大限度地減少實驗負擔。結合實時數據來重新確定最佳補料添加和工藝控制策略顯示出增強生物工藝開發的巨大潛力。然而，關鍵工藝參數的在線和在線分析技術應得到改進，以充分發揮基于模型的優化，在大多數情況下，對優化至關重要的底物利用率和產物形成等參數僅限于離線分析。對傳統技術（如色譜）的快速在線替代品的開發將特別有利于重新設計實驗策略。

盡管該綜述中討論的技術顯示出高效和低風險生物工藝開發的巨大潛力，但目前自動化培養平臺的高成本和復雜性限制了它們的廣泛應用。此外，這些技術和方法的標準化對于學術界和工業界的共同使用和接受至關重要，未來的工作還應側重于開發 FOSS 和 FOSH 以提高可訪問性。

曼森平行生物反應器分批補料應用

曼森采用Watson-malow 400A高精度泵頭，16 路補料，平均每個罐有四路補料，蠕動泵流量可設定，連續可調；每個蠕動泵的功能可單獨分配，可以作為酸泵、堿泵、補料泵、消泡泵、液位控制泵。