繼發(fā)部位轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)腸癌相關(guān)死亡的主要原因，也是結(jié)腸癌治療的主要障礙。因此，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的作用機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要而緊迫的意義。組蛋白轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；�酶(HDACs)是廣泛表達(dá)的酶，負(fù)責(zé)可逆和動(dòng)態(tài)的蛋白乙�；�，HDAC6是18種哺乳動(dòng)物HDACs中唯一的成員。在許多腫瘤中，HDAC6的過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，并與腫瘤原發(fā)期的晚期和預(yù)后不良有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為HDAC6與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的觀(guān)點(diǎn)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。AKAP12 (a激酶錨定蛋白12)是AKAPs家族成員，以時(shí)空方式組裝信號(hào)通路和細(xì)胞骨架蛋白，而至少50%的結(jié)腸癌患者中AKAP12表達(dá)減少或丟失。已有研究表明AKAP12是一種腫瘤/轉(zhuǎn)移抑制因子。然而，AKAP12去乙�；�在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制和作用尚不清楚。
 

2022年9月，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院李慧教授團(tuán)隊(duì)于Cancer Letters (IF 9.756)發(fā)表了題為“HDAC6-dependent deacetylation of AKAP12 dictates its ubiquitination and promotes colon cancer metastasis “文章，其研究了在HDAC6介導(dǎo)的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中，AKAP12去乙�；�的機(jī)制和功能意義。通過(guò)乙�；�修飾組學(xué)、蛋白免疫印跡等技術(shù)方法，研究表明AKAP12是HDAC6新的相互作用物和底物，并揭示了一種新的機(jī)制，即HDAC6通過(guò)調(diào)節(jié) AKAP12去乙�；�以及泛素化介導(dǎo)的降解來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。其中，中科新生命為該研究提供了乙�；�修飾組學(xué)服務(wù)。

研究材料

細(xì)胞：HCT-116，SW480，HEK293T

小鼠：BALB/C裸鼠

組織：人原發(fā)性結(jié)腸癌組織和癌旁組織

技術(shù)路線(xiàn)

步驟1：評(píng)估HDAC6與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；

步驟2：乙�；�修飾組學(xué)確定HDAC6的作用底物為AKAP12；

步驟3：確定HDAC6去乙酰化AKAP12的作用位點(diǎn)；

步驟4：探究AKAP12乙酰化與泛素化的串?dāng)_作用；

步驟5：穩(wěn)定表達(dá)AKAP12對(duì)HDAC6促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)的影響。

研究結(jié)果

1. HDAC6與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌數(shù)據(jù)進(jìn)行GEO（Gene Expression Omnibus）分析，發(fā)現(xiàn)與沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織相比，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織中HDAC6 mRNA顯著升高。之后研究者使用免疫組化實(shí)驗(yàn)來(lái)探究HDAC6在人結(jié)腸癌組織中蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果表明，70例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌標(biāo)本中，68.57%的腫瘤表達(dá)高水平的HDAC6蛋白，而在非轉(zhuǎn)移性人群中，HDAC6高表達(dá)僅為39.22%。接下來(lái)，研究者進(jìn)一步探究了HDAC6在體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)使用HDAC6去乙酰化酶抑制劑以及敲除HDAC6 均能在未改變細(xì)胞活力的情況下，顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、SW480和HCT-15的細(xì)胞遷移和侵襲能力。此外，在裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型中的研究表明，HDAC6高表達(dá)與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖1 HDAC6與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)

圖2 HDAC6缺失抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能

2. HDAC6與AKAP12相互作用

接下來(lái)，研究者開(kāi)始探究HDAC的潛在底物，闡明其調(diào)控機(jī)制。對(duì)HCT-116 shNT和shHDAC6細(xì)胞進(jìn)行乙�；�蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在888種蛋白質(zhì)中共鑒定到1435種獨(dú)特的賴(lài)氨酸乙�；�肽段，包括1479個(gè)獨(dú)特的乙�；�位點(diǎn)，并結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，研究者將關(guān)注點(diǎn)放在了AKAP12上。在通過(guò)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)證明HDAC與AKAP12存在著高度特異性的相互作用后，研究人員繼續(xù)研究AKAP12的HDAC6結(jié)合區(qū)域。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKAP12的PKC-和F-actin結(jié)合區(qū)是其與HDAC6相互作用所必需的。

圖3 HDAC6與AKAP12相互作用

3.  HDAC6調(diào)節(jié)AKAP12在K526/K531位點(diǎn)的去乙�；�

上述結(jié)果表明，HDAC6在A(yíng)KAP12的去乙酰化過(guò)程中具有特殊而顯著的作用，含有pkc結(jié)合基序的AKAP12-1-606是HDAC6介導(dǎo)的主要去乙酰化區(qū)域。進(jìn)一步的，研究者用質(zhì)譜法鑒定了AKAP12中對(duì)HDAC6反應(yīng)的乙�；�位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)K526和K531是位于pkc結(jié)合區(qū)的賴(lài)氨酸乙酰化位點(diǎn)。為了評(píng)估它們對(duì)AKAP12乙�；�的貢獻(xiàn)，將K526和K531分別(K526R/K531R)或完全(2KR)突變?yōu)榫�氨酸，這是一種類(lèi)似賴(lài)氨酸去乙�；癄顟B(tài)的電荷保留突變體。結(jié)果表明，K526和K531的精氨酸取代均能重現(xiàn)AKAP12乙酰化的缺失。因此，K526和K531可能與HDAC6對(duì)AKAP12的去乙�；�有關(guān)，且進(jìn)一步暗示AKAP12中pkc結(jié)合基序的關(guān)鍵作用。
 

圖4 HDAC6調(diào)節(jié)AKAP12的去乙酰化

圖5 AKAP12在K526/K531位點(diǎn)去乙�；�

4. HDAC6在K531對(duì) AKAP12去乙�；�有利于其泛素化，降低AKAP12穩(wěn)定性

研究人員觀(guān)察到HDAC6過(guò)表達(dá)不僅能夠?qū)е翧KAP12去乙酰化，還能致使其蛋白水平降低。因此研究人員探究了HDAC6降低AKAP12表達(dá)是否受到蛋白酶體降解的調(diào)節(jié)，以及AKAP12 中是否存在乙酰化和泛素化串?dāng)_。研究表明，HDAC6是通過(guò)泛素化-蛋白酶體降解途徑誘導(dǎo)AKAP12表達(dá)降低，由此研究者推測(cè)由HDAC6啟動(dòng)的一個(gè)潛在乙�；�和泛素化串?dāng)_碼可能參與AKAP12蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控。在上面講到，K526/K531是HDAC6對(duì)AKAP12去乙酰化作用的兩個(gè)主要位點(diǎn)。因此，研究者檢測(cè)了這兩個(gè)乙酰化位點(diǎn)是否參與蛋白酶體降解過(guò)程。結(jié)果顯示，HDAC6介導(dǎo)的AKAP12在K531處去乙�；�是其泛素化依賴(lài)性降解的原因。緊接著，研究人員通過(guò)western blot對(duì)65例結(jié)腸癌患者的生物樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中，相較于HDAC6低表達(dá)組，HDAC6高表達(dá)組中AKAP12低表達(dá)患者的比例顯著增加，而在相鄰正常結(jié)腸組織中，這一比例相似。這些結(jié)果表明，人結(jié)腸癌標(biāo)本中HDAC6水平與AKAP12水平之間可能存在負(fù)相關(guān)。

圖6 HDAC6 在K531位點(diǎn)對(duì)AKAP12去乙�；�并促進(jìn)其泛素化

5. HDAC6需要穩(wěn)定表達(dá)AKAP12來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)

有研究表明AKAP12在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用，為了深入了解穩(wěn)定表達(dá)AKAP12在HDAC6介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的意義，研究者通過(guò)敲除HDAC6及沉默表達(dá)AKAP12進(jìn)行研究。結(jié)果表明，HDAC6的敲除導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降，而抑制AKAP12的表達(dá)則能增加細(xì)胞活力，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了穩(wěn)定表達(dá)的AKAP12在HDAC6介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的重要性。此外，有明確證據(jù)表明AKAP12是PKC的主要底物，因此研究者評(píng)估了在HDAC6和AKAP12共沉默的細(xì)胞中觀(guān)察到的被拯救的細(xì)胞的活力是否與PKC亞型活性的改變有關(guān)。研究結(jié)果顯示，在HDAC6缺失情況下，生長(zhǎng)細(xì)胞顯示出磷酸化PKC α、β、δ、λ和ϛ蛋白水平的降低，而進(jìn)一步敲除AKAP12則使PKC信號(hào)通路重新激活。以上表明，穩(wěn)定表達(dá)的AKAP12是HDAC6介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)所必需的，且與PKC信號(hào)的激活部分相關(guān)。

圖7 HDAC6介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)需要AKAP12的穩(wěn)定表達(dá)

 小編小結(jié)

該文章的研究結(jié)果表明AKAP12是HDAC6的一個(gè)新的底物，并從AKAP12乙酰化和泛素化相互作用的角度揭示了HDAC6介導(dǎo)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。因此，開(kāi)發(fā)一種以HDAC6為靶點(diǎn)的治療策略具有深遠(yuǎn)的臨床意義，可以同時(shí)增強(qiáng)腫瘤抑制因子AKAP12的乙�；�并阻斷其泛素蛋白酶體依賴(lài)的降解。