當使用與樣本種屬來源一致的一抗時，會發生非特異性背景染色。如免疫組化實驗中一抗和樣本的種屬來源都是小鼠(M.O.M. staining)就是這個問題的一個常見例子。這篇文章為大家解答如何在這類實驗中防止非特異性背景信號的產生。

非特異性背景產生的原因
當使用與樣本種屬來源一致的一抗進行免疫染色實驗的時候，組織中的內源性免疫球蛋白會被二抗識別，而二抗無法區分一抗和同種內源性免疫球蛋白。因此會產生非特異性染色，并可掩蓋來自一抗的正確信號。

解決辦法
單價Fab片段可用于“屏蔽”或阻斷內源性Ig表位，使其無法被標記的二抗檢測。Fab片段只有一個抗原結合位點，因此它們不會捕獲后續步驟中使用的主抗體。相反，整個分子IgG和F(ab’)2片段是二價的(它們有兩個結合位點)，對阻斷內源性Ig無效。在與內源性Ig結合后，二價抗體可能有一個開放的結合位點，會捕獲在后續步驟重引入的一抗。

圖1. 抗體分子的分解(大約MW = 160 kDa)會產生許多不同的片段。木瓜蛋白酶消化產生兩個單價Fab片段和一個Fc片段，每個約50 kDa。胃蛋白酶消化降解Fc結構域，留下一個二價F(ab’)2片段，分子量約為110 kDa。

選擇與標記的二抗同宿主的Fab片段，如Fab fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，阻斷與標記的Goat Anti-Mouse IgG相結合。物種來源保持一致以確保Fab片段和標記的二抗之間沒有反應。此外，在同一物種中培養的Fab片段將識別并因此阻斷標記的次生分子識別的相同表位。不同的宿主動物可能會識別內源性Ig上不同的表位，阻斷可能是不完全的。

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阻斷細胞或組織切片上的內源性免疫球蛋白
·   將與一抗孵育后的樣本用5%的來自相同種類的正常血清進行阻斷。
·   繼續用與樣本種屬來源相同的無偶聯的Fab片段二抗(20-40μg/ml)進行孵育
·   接下來的步驟按照常規使用的protocol進行

陰性對照:通過去除實驗中的一抗，與標記的二抗孵育，可確認阻斷劑的阻斷效率。確認內源性信號確實被阻斷劑抑制后，繼續進行常規實驗。

當樣本的內源性IgG處于高水平時，可能需要將Fab抗體的濃度增加到100µg/ml。為了避免Fab抗體被標記的二抗取代，如果不影響目標蛋白的抗原性，可能需要用戊二醛進行輕微的后固定。

在Western blotting或ELISA應用中，Fab抗體對阻斷免疫球蛋白并不有效。

Min X：指經過吸附處理的二抗，可以最大程度的減少物種之間的交叉反應

♱在考慮使用經過吸附處理的抗體時應謹慎，因為這些抗體大大降低了表位識別能力，可能對一些單克隆抗體的識別能力較差。

*Anti-Hamster IgG (H+L) (min X Bov, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)可能不能識別所有亞美尼亞倉鼠單克隆抗體，因為它已經過近親物種的吸附處理(粗體部分)。因此，最好使用對較少種類吸附的抗體，如抗亞美尼亞倉鼠IgG (H+L) (min X Bov Sr Prot)，除非在需要在小鼠和/或大鼠免疫球蛋白存在的情況下檢測亞美尼亞倉鼠單克隆抗體。