AO/PI雙熒光染色技術操作使用指南

瀏覽次數：5074　發布日期：2022-9-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

臺盼藍染色作為活細胞計數的首選方式，可將細胞膜不完整的死細胞染成藍黑色，通過在鏡下和未被染色的活細胞進行對比并計數，從而可快速了解細胞樣品的活率和濃度。但在實際使用過程中，臺盼藍染色計數會出現以下問題：

臺盼藍染色的特異性不強，常會將原代細胞的碎片、PBMCs中殘留的紅細胞計入總數；

臺盼藍細胞毒性較大，且染料配制濃度無統一標準，導致在進行多樣品計數時由于間隔時間過久而結果誤差較大。

臺盼藍染色

而AO/PI染色法可解決這些問題。AO（Acridine Orange）又稱為吖啶橙，PI（Propidium Iodide）又稱為碘化丙錠，可分別將DNA染成綠色和紅色，而碎片和雜質或哺乳動物紅細胞由于沒有細胞核不會被染色，同時細胞毒性非常小，所以廣泛應用于原代細胞計數、細胞治療、生物制品等領域。

AO/PI雙熒光染色

多數情況下，市面上可以見到很多預配制的染液，細胞樣本在染液終濃度為2-25μg/mL時，孵育5–30分鐘，將可以發出明亮的核染色熒光。但是實際應用時，由于細胞類型、染色條件以及檢測儀器的參數不同，實際呈現的效果也不一樣。此時，只需按照下文中提供的染色方案即可獲得較為穩定的染色結果。

AO/PI快速染色方法：
①預先配置（50μg/mL PI， 10μg/mL AO）的染色預混液；

②吸取 10μL 細胞樣本至 EP 管中，加入等體積的 AO/PI 預混染色液，吹打混勻后孵育 5min（終濃度 25μg/mL PI， 5μg/mL AO）；

③輕微吹打后，吸取 10μL 染色后的細胞上樣至細胞計數板中進行分析，推薦使用瑞沃德自動細胞計數儀C100/C100-Pro，可精準區分AO/PI雙熒光染色后的活死細胞，一鍵計數，精準快速。