Gyrolab高通量宿主細胞蛋白分析系統在支持下游工藝開發的應用
近日，法國賽諾菲生物工藝分析部門科學家Suzana Petrovic，Yann Fromentin，Hervé Dubois等在BioProcess International期刊上發表了題為“Host-Cell Protein Analysis to Support Downstream Process Development”的文章[1]，介紹了該部門將Gyrolab免疫分析工作站與自動液體處理系統相結合，建立了全自動化的高通量宿主蛋白分析平臺的應用。本文節選自該文章。
宿主細胞蛋白(Host Cell Protein, HCP)是生物制品生產過程中產生的關鍵工藝相關雜質之一，雖然含量很低，但可能會導致患者出現不良免疫反應或導致產品蛋白的降解等，例如在Lebrikizumab的臨床試驗中曾報道了患者對Phospholipase B-like 2（PLBL2）雜質蛋白的免疫反應，從而不得不在后期改變工藝[2]；MCP-1 HCP也曾在幾個項目中被檢測到 [3]，由于嚴重的不良反應，導致一項臨床試驗暫停。另外，有研究發現Cathepsin D和L可以誘發終產品蛋白的降解[4,5]。因此，在下游工藝（DSP）開發中，需要通過實驗設計（DoE）優化每個純化工藝步驟以盡可能清除HCP殘留，并建立合適的HCP檢測方法來監控生物制品的質量。
ELISA是HCP檢測的黃金標準方法，但是基于微孔板的傳統ELISA具有以下局限：① 多個孵育和洗滌步驟，需要大量的動手操作和分析時間，樣品檢測通量非常有限；② 動態范圍很窄（±100 ng/mL），在DSP研究期間需要進行大量的重復檢測。這使得ELISA不能作為一種有效的分析支持來滿足DSP開發團隊日益增長的通量要求，因此該技術的自動化是極為必要的。
Gyrolab工作站是基于微流控技術的免疫分析平臺，將微孔板內的免疫反應體系微縮到納升級的CD微結構中。每片CD被分成96個微結構，每個微結構中有包被鏈霉親和素的親和微珠，通過生物素標記的捕獲試劑和熒光標記的檢測試劑來進行“夾心法”檢測。Gyrolab的優勢包括樣品和試劑體積要求低，更低的基質效應，更寬的動態范圍（±10,000 ng/mL）以及快速獲得結果等，因此被廣泛用于監管環境下臨床前和臨床研究中的PK/PD/TK等[6,7,8]。由于其高通量的巨大潛力，賽諾菲研究團隊將其應用于DSP生物分析中，將Bravo自動液體處理平臺（安捷倫科技）與Gyrolab免疫分析工作站結合起來建立了全自動化高通量分析平臺，以有效應對生物制品DSP開發中HCP檢測的挑戰。下文將說明這一平臺與ELISA標準方法的可比性，并通過比較賽諾菲三個生物制品研發基地的結果以展示該平臺在實際應用中的性能。
材料和方法
案例1-10：所有案例中的樣品均為賽諾菲內部產品，是由CHO細胞表達生產的單克隆抗體和片段。
ELISA檢測：Cygnus Technologies 公司Cygnus F550 CHO-HCP ELISA試劑盒，BioTek ELx50洗板機，Molecular Devices M5e分光光度計（450nm），由Softmax Pro 軟件進行數據處理。該ELISA方法作為本研究的參考方法。
Gyrolab檢測：Gyrolab xP免疫分析工作站，Bioaffy 1000 High Capacity CD，Gyrolab CHO-HCP #1 試劑盒，Gyrolab CHO-HCP 3G試劑盒，由Gyrolab Evaluator軟件控制和處理數據。
樣品稀釋：由安捷倫科技Bravo自動液體處理系統自動進行，V-Work軟件（12.3.0版）用于控制和編程。
檢測方法開發與驗證
Gyrolab CHO-HCP試劑盒是“交鑰匙”即用型試劑盒，使用標記的山羊抗CHO-HCP多克隆抗體作為捕獲和檢測試劑，以夾心法形式進行檢測。該抗體試劑與ELISA方法中所使用的試劑為同一供應商的相同試劑。在Bioaffy HC CD上進行的檢測結果表明，該方法定量限LoQ為3.2 ng/mL，且在多次評估實驗中一直保持一致。因此該方法對低HCP含量的樣品檢測具有足夠的靈敏度和穩健性，并與ELISA參考結果（LoQ 約3 ng/mL）有很好的相關性（Figure 1）。
接下來，對Gyrolab CHO-HCP檢測方法進行驗證，以確保該方法適用于預期用途。驗證方案采用與ELISA相同的方法和可接受標準�；谝呀⒌漠a品/工藝知識和樣品的可用性，在模型適用性（suitability）、專屬性（specificity）、準確性（accuracy）、稀釋線性度（linearity）、定量限（LoQ）、檢測限（LoD）、重復性（intra-assay precision）和中間精密度（inter-assay precision）等方面對Gyrolab檢測方法進行了驗證。如表1所示，驗證方案中規定的所有驗收標準均被滿足。
Gyrolab檢測結果與ELISA比較
在六個項目（case 2 -7）中對Gyrolab高通量HCP檢測方法和ELISA方法進行了平行比較，這六個項目代表了賽諾菲集團內開發的藥物分子的多樣性，包括抗體、片段和多特異性抗體。結果顯示，Gyrolab兩種CHO-HCP試劑盒和經典ELISA方法的結果在總HCP蛋白定量和清除率上均有很好的相關性（Figure2），說明Gyrolab技術能夠在藥物早期DSP開發過程中提供高通量支持，以減少人工操作時間、成本和重復測試需要，大幅提升分析周轉效率。
Cross-site評估
對Gyrolab檢測方法在三個不同基地之間的穩健性進行了評估，三個基地使用同樣的樣品和程序進行分析，樣品中HCP含量為ng/mL級�？绲攸c研究的結果如Figure 4所示，Gyrolab方法在賽諾菲全球不同基地之間多個項目中的檢測數據具有高度可比性，并且方法非常靈敏，能夠檢測到后續工藝步驟之間微小的變化，因此可將Gyrolab技術作為統一的分析平臺以支持賽諾菲全球所有生物制劑開發基地的工藝開發。
自動化高通量HCP分析平臺
上面的對比研究證明了Gyrolab技術的優勢，其具有出色的動態范圍、線性度、重復性和精密度，并與ELISA黃金標準方法呈現出良好的可比性。此外， Gyrolab平臺一次可以運行5片CD，獲得480個數據點，這樣的高通量允許一個樣品在幾個稀釋度下運行，以測試線性度、回收率和基質效應等。
高通量的分析模式對樣品制備工作的要求很高，譬如一個DSP DoE有60個待測樣品，需要360個不同的稀釋（每個樣品在三個稀釋度下進行摻入實驗）。為了解決樣品制備瓶頸，采用安捷倫科技公司的Bravo自動化液體處理平臺來處理大量的樣品，如Figure 6所示。
Gyrolab免疫分析工作站與Bravo自動液體處理平臺相結合，實現了完全自動化的高通量分析，該流程能夠在短短一天半的時間內完成所有檢測并獲得結果：第一天，設置好設備，使用Bravo自動準備和稀釋樣品，接下來Gyrolab運行過夜；第二天早上，Gyrolab 即可獲得數據并進行分析。
這種自動化的高通量分析方法能夠為DSP開發實驗室提供有效的支持：① 快速的分析周轉效率（1天內即可獲得結果）；②出色的檢測通量（每次運行多達90個樣品，包括兩個稀釋度和摻入）；③數據質量可靠，結果可重復性高。總體上，這種方法提高了生物分析部門的效率，大大減少了手工操作時間，根除了因稀釋錯誤或人為操作誤差導致的重測要求，并大幅提高了分析結果的產量、質量和可重復性。
參考文獻
[1]. Petrovic S, et.al. Host-Cell Protein Analysis to Support Downstream Process Development: A High-Throughput Platform with Automated Sample Preparation. BioProcess International. November-December 2019, 17(11-12)
[2]. Fischer SK, et al. Specific Immune Response to Phospholipase B-Like 2 Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material. AAPS J. 19(1) 2017: 254–263; doi:10.1208/s12248-016-9998-7.
[3]. Vanderlaan M, et al. Experience with Host Cell Protein Impurities in Biopharmaceuticals. Biotechnol. Prog. 34(4) 2018: 828-837;doi:10.1002/btpr.2640.
[4]. Bee JS, et al. Trace Levels of the CHO Host Cell Protease Cathepsin D Caused Particle Formation in a Monoclonal Antibody Product. Biotechnol. Prog. 31(5) 2015: 1360– 1369; doi:10.1002/btpr.2150.
[5]. Luo H, et al. Cathepsin L Causes Proteolytic Cleavage of CHO Expressed Proteins During Processing and Storage: Identification, Characterization, and Mitigation. Biotechnol. Prog. 35(1) 2018: e2732; doi:10.1002/btpr.2732.
[6]. Liu R, et al. Accelerating Regulated Bioanalysis for Biotherapeutics: Case Examples Using a Microfluidic Ligand Binding Assay Platform. AAPS J. 19(1) 2017; 82–91; doi:10.1208/s12248-016-0006-z.
[7]. Noguchi Y, et al. Pharmacokinetics of an Intracerebroventricularly Administered Antibody in Rats. MAbs 9(7) 2017: 1210– 1215;doi:10.1080/19420862.2017.1345834.
[8]. Jordan G, et al. Platform Switching from ELISA to Gyrolab™: A Novel Generic Reagent Omits the Need to Change Critical Reagents. Bioanalysis 8(8) 2016: 807–814; doi:10.4155/bio-2015-0011.
宿主細胞蛋白(Host Cell Protein, HCP)是生物制品生產過程中產生的關鍵工藝相關雜質之一，雖然含量很低，但可能會導致患者出現不良免疫反應或導致產品蛋白的降解等，例如在Lebrikizumab的臨床試驗中曾報道了患者對Phospholipase B-like 2（PLBL2）雜質蛋白的免疫反應，從而不得不在后期改變工藝[2]；MCP-1 HCP也曾在幾個項目中被檢測到 [3]，由于嚴重的不良反應，導致一項臨床試驗暫停。另外，有研究發現Cathepsin D和L可以誘發終產品蛋白的降解[4,5]。因此，在下游工藝（DSP）開發中，需要通過實驗設計（DoE）優化每個純化工藝步驟以盡可能清除HCP殘留，并建立合適的HCP檢測方法來監控生物制品的質量。
ELISA是HCP檢測的黃金標準方法，但是基于微孔板的傳統ELISA具有以下局限：① 多個孵育和洗滌步驟，需要大量的動手操作和分析時間，樣品檢測通量非常有限；② 動態范圍很窄（±100 ng/mL），在DSP研究期間需要進行大量的重復檢測。這使得ELISA不能作為一種有效的分析支持來滿足DSP開發團隊日益增長的通量要求，因此該技術的自動化是極為必要的。
Gyrolab工作站是基于微流控技術的免疫分析平臺，將微孔板內的免疫反應體系微縮到納升級的CD微結構中。每片CD被分成96個微結構，每個微結構中有包被鏈霉親和素的親和微珠，通過生物素標記的捕獲試劑和熒光標記的檢測試劑來進行“夾心法”檢測。Gyrolab的優勢包括樣品和試劑體積要求低，更低的基質效應，更寬的動態范圍（±10,000 ng/mL）以及快速獲得結果等，因此被廣泛用于監管環境下臨床前和臨床研究中的PK/PD/TK等[6,7,8]。由于其高通量的巨大潛力，賽諾菲研究團隊將其應用于DSP生物分析中，將Bravo自動液體處理平臺（安捷倫科技）與Gyrolab免疫分析工作站結合起來建立了全自動化高通量分析平臺，以有效應對生物制品DSP開發中HCP檢測的挑戰。下文將說明這一平臺與ELISA標準方法的可比性，并通過比較賽諾菲三個生物制品研發基地的結果以展示該平臺在實際應用中的性能。
材料和方法
案例1-10：所有案例中的樣品均為賽諾菲內部產品，是由CHO細胞表達生產的單克隆抗體和片段。
ELISA檢測：Cygnus Technologies 公司Cygnus F550 CHO-HCP ELISA試劑盒，BioTek ELx50洗板機，Molecular Devices M5e分光光度計（450nm），由Softmax Pro 軟件進行數據處理。該ELISA方法作為本研究的參考方法。
Gyrolab檢測：Gyrolab xP免疫分析工作站，Bioaffy 1000 High Capacity CD，Gyrolab CHO-HCP #1 試劑盒，Gyrolab CHO-HCP 3G試劑盒，由Gyrolab Evaluator軟件控制和處理數據。
樣品稀釋：由安捷倫科技Bravo自動液體處理系統自動進行，V-Work軟件（12.3.0版）用于控制和編程。
檢測方法開發與驗證
Gyrolab CHO-HCP試劑盒是“交鑰匙”即用型試劑盒，使用標記的山羊抗CHO-HCP多克隆抗體作為捕獲和檢測試劑，以夾心法形式進行檢測。該抗體試劑與ELISA方法中所使用的試劑為同一供應商的相同試劑。在Bioaffy HC CD上進行的檢測結果表明，該方法定量限LoQ為3.2 ng/mL，且在多次評估實驗中一直保持一致。因此該方法對低HCP含量的樣品檢測具有足夠的靈敏度和穩健性，并與ELISA參考結果（LoQ 約3 ng/mL）有很好的相關性（Figure 1）。
接下來，對Gyrolab CHO-HCP檢測方法進行驗證，以確保該方法適用于預期用途。驗證方案采用與ELISA相同的方法和可接受標準�；谝呀⒌漠a品/工藝知識和樣品的可用性，在模型適用性（suitability）、專屬性（specificity）、準確性（accuracy）、稀釋線性度（linearity）、定量限（LoQ）、檢測限（LoD）、重復性（intra-assay precision）和中間精密度（inter-assay precision）等方面對Gyrolab檢測方法進行了驗證。如表1所示，驗證方案中規定的所有驗收標準均被滿足。
Gyrolab檢測結果與ELISA比較
在六個項目（case 2 -7）中對Gyrolab高通量HCP檢測方法和ELISA方法進行了平行比較，這六個項目代表了賽諾菲集團內開發的藥物分子的多樣性，包括抗體、片段和多特異性抗體。結果顯示，Gyrolab兩種CHO-HCP試劑盒和經典ELISA方法的結果在總HCP蛋白定量和清除率上均有很好的相關性（Figure2），說明Gyrolab技術能夠在藥物早期DSP開發過程中提供高通量支持，以減少人工操作時間、成本和重復測試需要，大幅提升分析周轉效率。
Cross-site評估
對Gyrolab檢測方法在三個不同基地之間的穩健性進行了評估，三個基地使用同樣的樣品和程序進行分析，樣品中HCP含量為ng/mL級�？绲攸c研究的結果如Figure 4所示，Gyrolab方法在賽諾菲全球不同基地之間多個項目中的檢測數據具有高度可比性，并且方法非常靈敏，能夠檢測到后續工藝步驟之間微小的變化，因此可將Gyrolab技術作為統一的分析平臺以支持賽諾菲全球所有生物制劑開發基地的工藝開發。
自動化高通量HCP分析平臺
上面的對比研究證明了Gyrolab技術的優勢，其具有出色的動態范圍、線性度、重復性和精密度，并與ELISA黃金標準方法呈現出良好的可比性。此外， Gyrolab平臺一次可以運行5片CD，獲得480個數據點，這樣的高通量允許一個樣品在幾個稀釋度下運行，以測試線性度、回收率和基質效應等。
高通量的分析模式對樣品制備工作的要求很高，譬如一個DSP DoE有60個待測樣品，需要360個不同的稀釋（每個樣品在三個稀釋度下進行摻入實驗）。為了解決樣品制備瓶頸，采用安捷倫科技公司的Bravo自動化液體處理平臺來處理大量的樣品，如Figure 6所示。
Gyrolab免疫分析工作站與Bravo自動液體處理平臺相結合，實現了完全自動化的高通量分析，該流程能夠在短短一天半的時間內完成所有檢測并獲得結果：第一天，設置好設備，使用Bravo自動準備和稀釋樣品，接下來Gyrolab運行過夜；第二天早上，Gyrolab 即可獲得數據并進行分析。
這種自動化的高通量分析方法能夠為DSP開發實驗室提供有效的支持：① 快速的分析周轉效率（1天內即可獲得結果）；②出色的檢測通量（每次運行多達90個樣品，包括兩個稀釋度和摻入）；③數據質量可靠，結果可重復性高。總體上，這種方法提高了生物分析部門的效率，大大減少了手工操作時間，根除了因稀釋錯誤或人為操作誤差導致的重測要求，并大幅提高了分析結果的產量、質量和可重復性。
參考文獻
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[6]. Liu R, et al. Accelerating Regulated Bioanalysis for Biotherapeutics: Case Examples Using a Microfluidic Ligand Binding Assay Platform. AAPS J. 19(1) 2017; 82–91; doi:10.1208/s12248-016-0006-z.
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[8]. Jordan G, et al. Platform Switching from ELISA to Gyrolab™: A Novel Generic Reagent Omits the Need to Change Critical Reagents. Bioanalysis 8(8) 2016: 807–814; doi:10.4155/bio-2015-0011.
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