外泌體純不純，一聞就知
以外泌體為基礎的細胞間通訊橫跨所有生命領域。多項研究表明，與傳統的合成載體相比，外泌體在藥物遞送方面具有若干優勢，為現代藥物輸送開辟了新領域，使得外泌體近年來備受科研、產業界乃至資本市場的關注。但是以外泌體為基礎的治療的臨床轉化仍然面臨著諸多挑戰。其中，如何精準且快速地實現外泌體治療制劑的質量控制成為外泌體產業化領域目前亟需解決的一項問題。2022年5月10日，國家發展改革委印發《“十四五”生物經濟發展規劃》（以下簡稱《規劃》）。《規劃》明確指出需建設外泌體治療產品等新型治療制劑及方案的質量及安全性評價技術平臺。
外泌體來源環境復雜，其中往往存在大量脂蛋白、蛋白團聚體及其他非囊泡組分。高純度外泌體的分離制備成為高質量外泌體制劑研發和生產的先決條件。但是由于外泌體不僅個體極其微小，攜載的蛋白、核酸、脂類等“貨物分子”含量極低，而且因來源細胞、細胞狀態以及分泌途徑的不同使得外泌體在尺寸、膜蛋白和內含物等方面存在高度的個體差異性和多樣性。這些固有因素提出了在單顆粒水平對外泌體質量評估的這一重要需求。
傳統表征方案
i. 至少3個外泌體標志蛋白（膜表面蛋白以及內腔蛋白）
ii. 至少一個陰性蛋白
i.電鏡成像
ii.其他非電鏡的單顆粒表征平臺
此外，目前尚且沒有關于工業生產外泌體的統一質量評估標準。因此，探索和確立適用于外泌體相關治療產品的質控標準，將極大推動這一領域發展。
外泌體產品的多維度質量控制從外泌體的結構和組成出發，針對粒徑、濃度和純度等物理參數以及蛋白、核酸等生化指標，NanoFCM提出如下（圖1）質量控制建議。
圖1. 單EV水平的質量控制方法
圖2. 單外泌體水平的粒徑及濃度表征（左）稀釋性測試（右）
圖3. NanoFCM散射性能和稀釋線性
(2) Triton X-100測定純度
Triton X-100是一種表面活性劑，可裂解外泌體的膜結構。可通過對比裂解前后外泌體樣品的顆粒數變化，得到外泌體樣本純度。如圖4所示，經Triton X-100處理，該外泌體樣品中顆粒數目明顯下降，計算可得該外泌體樣品純度為66.0%。
圖4. 基于Triton X-100膜處理的外泌體純度檢測
(3) 膜染料測定純度
公司自主開發的膜染料可實現對外泌體樣品中含有膜結構的顆粒的標記，從而實現樣本純度分析。如圖5所示，經綠色熒光脂膜染料染色，該樣本中79.5%的顆粒因具有膜結構而被該脂膜染料標記，且熒光強度與顆粒粒徑呈現正相關。該膜染料不與膜結構結合時無本底熒光信號，嵌入脂膜后熒光信號大大增強，因此無需去除游離染料，與傳統膜染料相比使用更為便捷。
近年來，基于外泌體核酸的疾病診斷和治療的相關研究呈現井噴式發展。通過核酸染料標記的方式可以實現外泌體上核酸的定位分析，包括內部、表面和游離狀態的核酸，對核酸的豐度和狀態進行綜合分析。
結合SYTO 16核酸染料標記及酶處理策略，利用NanoFCM對外泌體中DNA分子的存在形式及分布特征在單顆粒水平進行了詳細分析（圖7），外泌體運載的DNA分子主要為dsDNA；外部粘附DNA的外泌體粒徑相對較小，而內部包裹DNA的外泌體粒徑相對較大；經超速離心和SEC方法制備的外泌體樣本中存在著大量與囊泡顆粒不相關的游離DNA分子。
NanoFCM除了可實現基于以上多種方法的外泌體質量控制，在載藥效率、配體修飾水平等方向亦可實現快速精確檢測，為外泌體臨床科研及產業化的發展提供助力。如您需要以上相關檢測方案或申請樣機試用，可掃描下方客服微信二維碼聯系我們。
參考文獻
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