多重免疫分析具有許多優(yōu)點(diǎn)，如可以從每個(gè)樣本中獲取更多的生物信息，更高的通量以及（在許多情況下）降低成本。多標(biāo)實(shí)驗(yàn)還通過(guò)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)測(cè)量所有分析物來(lái)消除其他變量的影響，例如測(cè)定溫度，緩沖液系統(tǒng)和操作員。開(kāi)發(fā)多重免疫測(cè)定的主要挑戰(zhàn)是不同分析物的濃度和表達(dá)模式可能會(huì)有很大差異。這可以通過(guò)仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)解決。

1. 了解樣本信息
為了使多重免疫測(cè)定生成可靠的數(shù)據(jù)，必須對(duì)其進(jìn)行配置以確保準(zhǔn)確檢測(cè)所討論的每種分析物。分析物的豐度和表達(dá)位置可能不同；雖然有些分析物是細(xì)胞內(nèi)的，但其他分析物在細(xì)胞表面表達(dá)或作為分泌的生物分子表達(dá)。在某些情況下，可能需要刺激分析物表達(dá)（例如，通過(guò)與生長(zhǎng)因子一起孵育）或鑒定特定的蛋白質(zhì)亞型。UniProt和PAXdb等開(kāi)放獲取資源提供有關(guān)蛋白質(zhì)豐度，已知異構(gòu)體和翻譯后修飾（PTM）的信息，而出版物和抗體數(shù)據(jù)表是其他有用的資源。

2. 考慮所需的多路復(fù)用級(jí)別
多重免疫測(cè)定的復(fù)雜性范圍很廣，包括靶蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)和同一膜上的上樣物對(duì)照，通過(guò)對(duì)組織切片中3或4種不同蛋白質(zhì)的免疫組化（IHC）分析，到基于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)由單個(gè)細(xì)胞表達(dá)的多達(dá)20種不同的分析物。使用基于磁珠的檢測(cè)或抗體陣列，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)百個(gè)生物分子。作為一般規(guī)則，對(duì)特定分析物的了解越少，所需的多重檢測(cè)水平就越高;雖然檢測(cè)盡可能多的靶標(biāo)可能很誘人，但分析物的數(shù)量應(yīng)與每次測(cè)試的成本以及測(cè)定開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證所涉及的工作量相平衡。

3. 鑒定合適的分析物特異性抗體
分析物特異性抗體是多重免疫測(cè)定的關(guān)鍵成分，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇。首先，應(yīng)針對(duì)預(yù)期應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，抗體制造商的數(shù)據(jù)表為抗體性能提供支持證據(jù)。同樣重要的是需要滴定抗體以鑒定可接受的信號(hào)窗口;這包括分析物特異性抗體和將用于檢測(cè)的任何二抗。單克隆抗體具有批次間性能一致和保證長(zhǎng)期供應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。然而，由于多克隆可以通過(guò)識(shí)別幾種表位來(lái)提供信號(hào)放大，因此它們可以成為檢測(cè)稀有分析物的首選。通常的做法是在同一實(shí)驗(yàn)中將單克隆和多克隆抗體組合在一起以進(jìn)行多重檢測(cè)。

4. 選擇兼容的二抗
除非可與酶或熒光團(tuán)偶聯(lián)分析物特異性抗體，否則二抗是實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)檢測(cè)的必需試劑。重要的是，二抗可以提供信號(hào)擴(kuò)增，這意味著它們通常被納入多重免疫測(cè)定工作流程中，以確保檢測(cè)低豐度靶標(biāo)。在選擇二抗試劑時(shí)，確認(rèn)它們與分析物特異性抗體相容至關(guān)重要 - 例如，山羊抗兔二級(jí)試劑將用于檢測(cè)在兔宿主中培養(yǎng)的分析物特異性抗體。 亞類特異性二抗提供了并行使用來(lái)自同一宿主物種的幾種抗體的靈活性，前提是它們的特異性已得到制造商的確認(rèn)，而交叉吸附的二抗（Min X）可最大限度地減少物種交叉反應(yīng)性，這可能是不需要的背景信號(hào)的來(lái)源。當(dāng)其他一抗選項(xiàng)不可用時(shí)，也有標(biāo)記來(lái)自同一宿主物種的兩種一抗的策略。 

5. 確定是否需要額外的信號(hào)放大
雖然多克隆分析物特異性抗體和二抗試劑都提供信號(hào)擴(kuò)增，但有時(shí)可能需要進(jìn)一步增強(qiáng)測(cè)定信號(hào)。一種流行的方法是使用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素（LSAB）信號(hào)擴(kuò)增，即在加入標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)之前，分析物特異性抗體被生物素化的二抗結(jié)合。在這種情況下，信號(hào)放大是通過(guò)1）多個(gè)生物素附著在每個(gè)二抗上和2）鏈霉親和素的四聚體性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其每個(gè)分子具有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，增加了親和力。

6.使用在線工具
在大多數(shù)情況下，多重免疫測(cè)定依賴于熒光讀數(shù)（免疫印跡是一個(gè)例外，其中化學(xué)發(fā)光檢測(cè)可用于同時(shí)可視化具有不同分子量的兩個(gè)條帶），并且建議將明亮的熒光團(tuán)與稀有靶標(biāo)配對(duì)，反之亦然。隨著靶標(biāo)分析物數(shù)量的增加，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變得越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性，特別是對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，在同一實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)到多達(dá)20種不同的生物分子。 Spectra Viewer等在線工具通過(guò)提供熒光團(tuán)激發(fā)和發(fā)射光譜的可視化來(lái)簡(jiǎn)化面板設(shè)計(jì)，從而快速評(píng)估熒光團(tuán)兼容性。

7. 記得確認(rèn)批次間的一致性
多重免疫測(cè)定涉及使用廣泛的抗體選擇，隨著時(shí)間的推移，每種抗體將包含不同的批次。建議研究人員在每次購(gòu)買新批次時(shí)測(cè)試抗體性能 - 包括分析物特異性抗體和二抗試劑 - 以確保可重復(fù)的結(jié)果。對(duì)于涉及大量樣品的研究，或那些將在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的研究，直接從制造商處購(gòu)買（或保留）大量抗體試劑可能是明智的。

8. 始終包括適當(dāng)?shù)目刂?/span>
質(zhì)控品對(duì)于任何免疫測(cè)定都是必不可少的，它們用于監(jiān)測(cè)測(cè)定性能和驗(yàn)證結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生最大的測(cè)定信號(hào)，而陰性對(duì)照提供非特異性結(jié)合的指示;兩者都應(yīng)包含在每個(gè)免疫測(cè)定中，無(wú)論檢測(cè)到的不同靶標(biāo)的數(shù)量如何。其他類型的對(duì)照包括僅二抗對(duì)照，旨在評(píng)估在沒(méi)有分析物特異性抗體的情況下的二抗結(jié)合;補(bǔ)償對(duì)照，用于通過(guò)用單個(gè)熒光團(tuán)染色樣品來(lái)評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)中的光譜重疊;和同種型對(duì)照（包含與分析物特異性抗體具有相同同種型和濃度但不能識(shí)別靶標(biāo)的抗體），用于 IHC 和流式細(xì)胞術(shù)，以幫助識(shí)別背景染色的來(lái)源。

9. 考慮整合自動(dòng)化
自動(dòng)化通過(guò)提高樣品通量和提高實(shí)驗(yàn)一致性來(lái)補(bǔ)充多路復(fù)用的優(yōu)勢(shì)。它還降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，有助于防止對(duì)身體的重復(fù)性勞損，并釋放研究人員的時(shí)間用于其他任務(wù)。自動(dòng)化選項(xiàng)包括可同時(shí)分配96個(gè)等分試樣的多通道分配器，IHC染色系統(tǒng)和全自動(dòng)免疫測(cè)定平臺(tái);這些都是值得考慮的，作為簡(jiǎn)化多路復(fù)用工作流程的策略。

10.使用高品質(zhì)二抗產(chǎn)品
進(jìn)行多標(biāo)記免疫測(cè)定可能讓人無(wú)從下手，但Jackson ImmunoResearch（一家為生命科學(xué)應(yīng)用提供二抗的專業(yè)原始生產(chǎn)商）可以為您提供幫助。JIR公司提供與熒光蛋白（包括 R-PE、APC 和 PerCP）和熒光染料（包括 Alexa Fluor®、亮紫色和羅丹明紅™）偶聯(lián)的二抗，以及亞類特異性二抗、交叉吸附二抗、生物素化二抗、并標(biāo)記鏈霉親和素。