His標簽是一種流行的重組蛋白的添加物，以促進蛋白質的純化和檢測。His標簽的使用通常優先于其他標簽，因為可使用相對便宜的樹脂進行純化，如NiNTA。Anti-His Tag抗體能夠檢測標記的蛋白，從而篩選表達。多聚his標簽通常由6個組氨酸殘基組成，但也可能在3 - 10個組氨酸殘基之間，通常位于重組蛋白的C端或n端。在這里，我們給大家介紹Jackson ImmunoResearch公司的Anti-His Tag抗體對his標記蛋白的WB和ELISA中的應用。

使用WB在細胞裂解液中篩選his標記的蛋白
從細胞裂解物中篩選his標記的重組蛋白(構建)是抗his標簽抗體的一種流行應用。Anti-His Tag抗體允許檢測羧基端和氨基端his標記蛋白。圖1展示了從哺乳動物、昆蟲和細菌細胞裂解液中檢測重組his標記蛋白的結果。

圖  1：在一系列細胞裂解物中檢測 His 標簽蛋白。以100 ng的濃度將C末端His-Tagged蛋白添加到細胞裂解物中。將HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆蟲細胞的細胞裂解物還原并在100°C下煮沸5分鐘，然后以9μg/孔的速度加載到串聯SDS凝膠中。A.蛋白質印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用PBS/0.2%  Tween  20中的5% BSA封閉，并用Jackson  ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探測以1:20K稀釋并使用數字成像儀進行可視化。 B.凝膠用Coomassie染色。

使用偶聯的Anti-His Tag抗體進行直接檢測法WB實驗
Jackson ImmunoResearch公司的Anti-His Tag抗體可以直接使用HRP偶聯物。圖2和3顯示了JIR公司的HRP Rabbit Anti-His Tag抗體可以在不同稀釋倍數范圍內使用，并且可以實現對不同his標記蛋白的敏感檢測。Western blot檢測的靈敏度可以通過間接進行檢測來提高，使用偶聯二抗體來實現以下部分所示的信號增強。

圖2. WB實驗結果顯示使用兩種濃度的HRP Rabbit Anti-His Tag抗體檢測His-Tagged蛋白。

具體實驗步驟：將重組His-Tagged蛋白還原，在100℃下煮沸5分鐘，裝入50、100和250 ng/孔的SDS凝膠中。將凝膠電泳到硝化纖維膜上，然后將膜減半，每組樣品在1:5K或1:50K下使用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)進行探針檢測。用數字成像儀顯示得到的條帶，1:5K印跡暴露3秒，1:50K印跡暴露21秒。
 

圖3. 直接Western blot檢測HRP兔抗- his Tag抗體對4種重組His-Tagged蛋白的檢測限。

具體實驗步驟：將4個重組His-Tagged蛋白還原，在100℃下煮沸5分鐘，分別裝入50 ng/孔和250 ng/孔的SDS凝膠中。1、2、4號通道含有c端標記蛋白，3號通道含有n端標記蛋白。將凝膠電泳到硝化纖維膜上，用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)稀釋1:20K進行探針檢測。結果的波段用數字成像儀顯示出來。

將Anti-His Tag抗體與Anti-Rabbit偶聯物結合，提高結果靈敏度
信號放大可以通過使用Anti-His Tag抗體和與Anti-Rabbit抗體(如HRP Goat Anti-Rabbit二抗)相結合的方法間接檢測His標簽來實現。圖4顯示，相對于直接檢測法(A)，使用間接兩步法(B)可以提高靈敏度。

圖4. 四種重組his標簽蛋白的直接和間接Western blot檢測比較。

具體實驗步驟：將his標記的蛋白在含有5% β -巰基乙醇(BME)的SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸并還原，并以50 ng/孔加載，詳細信息如上。凝膠被電印跡到硝化纖維素上，并進行了印跡探測。A)直接:HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)稀釋1:20K。B)間接法:Rabbit Anti-His Tag(300-005-240)稀釋1:5K，然后使用HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Ms, Rat Sr Prot)(111-035-144)稀釋1:20K。用數字成像儀對印跡進行可視化。

Anti-His Tag抗體在ELISA中的應用
圖5顯示了一系列重組His-Tagged羊駝VHH抗體的結合特性的變化，這些抗體從抗antigen X的活性篩選中分離出來，并通過ELISA進行分析。不同的納米體的結合親和力的變化可以被清楚地識別和以供實驗人員進行選擇。

圖5. 使用HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240) 在ELISA實驗中對His標簽蛋白進行檢測

具體實驗細節：
1.抗原包被：Antigen X以1μg/孔(100 ul, 10 μg/ml)涂于平板上。用1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free） (001-000-162)在PBST中阻斷平板。
2.樣本：5個純化his標記的重組羊駝VHH抗抗原X抗體(Protein 1-5)，連續稀釋20 ng (100 ul @ 200 ng/ml); 1:2穿過盤子。
3.檢測抗體：HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)按1:20 000稀釋(每孔100 μl)。
4.平板與TMB在室溫孵育30分鐘，用平板閱讀器在620 nm時讀取實驗數據。

使用ELISA篩選來捕獲his標簽蛋白
His-Tag提供了另一種捕獲蛋白質的方法，這種方法在處理具有構象敏感性的蛋白質時可能很有用，它可以使蛋白質高于板表面，使更多的抗原表位可被免疫試劑接近。Anti-His Tag抗體的另一個應用是在目標蛋白特異性抗體有限的情況下，但該檢測需要兩種不同的抗體來生成三明治格式。通過His標簽捕獲，目標蛋白特異性抗體可用于檢測與結合物種特異性二抗的復合物，允許最佳的信號擴增。His-Tag捕獲還提供抗體介導的，快速和一致的抗原結合到ELISA板。

圖6。Rabbit Anti-His Tag (300-005-240)間接夾心ELISA法檢測his標記蛋白。

1.捕獲抗體: AffiniPure Rabbit Anti-His Tag(300-005-240)包被1μg/孔(100 μl, 10 μg/ml)。用1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free)(001-000-162)在PBST中阻斷平板
2.樣品:His-Tagged SARS-CoV-2刺突蛋白RBD (Genscript - Z03483-100)，負載在20 ng/孔(100 μl @ 200 ng/ml)。 
3.檢測抗體1:人抗sars - cov -2 IgG Spike S1抗體(Genscript A02038)。第一口孔40 ng (100 ul @ 400 ng/ml);連續稀釋1:2橫跨板。 
4.檢測抗體2:HRP Goat Anti-Human IgG, Fcγfragment specific (min X Bov, Ms, Rb Sr Prot) (109-035-170)稀釋1:20 000 (100μl /孔)。 
5.平板與TMB在室溫孵育30分鐘，用平板閱讀器在620 nm讀取。

*實驗tip：在捕獲過程中使用兔抗體時，建議使用與兔血清蛋白交叉吸附的檢測抗體，以避免背景的產生。Jackson ImmunoResearch研的抗體，包括anti-human抗體，對多種宿主可以消除其交叉反應性，使得不同宿主物種都能消除高背景。