目前可通過敲入基因的手段實現對小膠質細胞的標記，通過病毒載體工具實現對小膠質細胞的特異性操縱。基于病毒的基因傳遞系統的兩個主要組成部分是：首先由結構蛋白和酶組成的包裝元件，合成病毒；其次，在細胞類型特異性啟動子下驅動的編碼感興趣基因的轉移載體。

早期利用2型和6型腺相關病毒AAV為載體， F4/80和 CD68為啟動子實現特異性標記小膠質細胞，但是感染細胞的效率低、存在部分脫靶、引起組織免疫反應等問題。

2022年7月25日北京生命科學研究所羅敏敏林睿團隊開發了高效、便捷、一體化操縱小膠質細胞的AAV病毒載體工具，極大促進小膠質細胞的功能研究。
 

1、 體內外高效感染小膠質細胞的AAV病毒突變體

研究人員通過體外實驗通過隨機插入氨基酸序列引起突變，篩選了能夠實現較高轉染小膠質細胞效率的衣殼蛋白AAV-cMG.QRP (~55%) 和AAV-cMG.WPP (~75%)。相比之下，AAV5衣殼蛋白感染效率不到12%, AAV9衣殼蛋白感染效率不到10%,轉染效率最高的AAV8也只到34%。

為了實現更高的感染效率，他們對AAV-cMG.QRP和AAV-cMG.WPP進行突變篩選，通過體外實驗發現在 594-596 位包含PAD氨基酸序列的AAV-cMG.QRP突變體（AAV-cMG），能夠達到86%的感染效率。

通過Cx3cr1-cre工具小鼠在體篩選了在587–589氨基酸序列兩個AAV-cMG.WPP突變體AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，這兩種突變體包裝的AAV病毒能夠在體感染80%以上的小膠質細胞，而且不引起小膠質細胞的激活。
 

圖1：高效感染小膠質細胞的AAV-MG1.1和 AAV-MG1.2
 

2、感染小膠質細胞的AAV病毒突變體多應用場景

將AAV-MG1.2包裝成鈣離子指示劑注射到Cx3cr1-cre工具小鼠體感皮層后，腹腔注射脂多糖刺激后可明顯觀察到體感皮層小膠質細胞胞體鈣離子信號的增加。這就表明AAV-MG1.2可用于追蹤小膠質細胞活性變化。

將AAV-MG1.2包裝成ATP熒光探針注射到Cx3cr1-cre工具小鼠體感皮層后，在脂多糖刺激2小時后可小膠質細胞胞體ATP熒光增加達到高峰，這一增加可持續6小時。這就表明AAV-MG1.2可用于追蹤小膠質細胞胞外ATP水平變化。

進一步利用AAV-MG1.2表達Cas9系統在向導RNA靶向嘌呤能受體基因P2ry12后可實現特異性敲除小膠質細胞的P2ry12。在敲除P2ry12后，小膠質細胞不能快速募集到組織損傷的部位，表明小膠質細胞功能受損。這就表明AAV-MG1.2可用于基因編輯小膠質細胞的功能基因。

總結

本文開發了能夠高效感染小膠質細胞的AAV突變體AAV-MG1.1 and AAV-MG1.2，利用這些突變體攜帶不同的功能基團可實現標記、觀察小膠質細胞和敲除特異性表達在小膠質細胞的基因，為小膠質細胞的功能研究提供了“利器”。
 

END

想了解更多內容，獲取相關咨詢請聯系

 電話 ： +86-0731-84428665    

聯系人：伍經理 +86-180 7516 6076