代謝組學揭示肥料和農藥混合使用可提高黃瓜果實品質，促進農藥在果實中的消散
文章標題：Metabolomics analysis of cucumber fruit in response to foliar fertilizer and  pesticides using UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS
發表期刊：Food Chemistry
發表時間：2021年8月
影響因子：7.514
合作客戶：中國農業大學
百趣生物提供服務：非靶標代謝組學
研究背景
黃瓜(Cucumis sativus L.)被認為是最健康的蔬菜之一，因為它為人體提供各種營養，如葫蘆素、木脂素和黃酮類化合物。黃瓜產量高，經濟效益好，在我國大棚中廣泛種植。由于溫室栽培黃瓜具有高溫、高濕、通風不良、土壤更新困難等特點，而黃瓜根系本身對土壤環境敏感，導致溫室栽培黃瓜面臨蟲害、營養不良等諸多問題，農藥和化肥常用于提高黃瓜產量和品質。
但由于代謝物的高度復雜性和設備的限制，研究這種混合施用對黃瓜代謝的影響受到限制。
本文采用配備有加熱電噴霧電離（HESI）源的超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜分析黃瓜果實中的代謝物譜。結合代謝組學和表型研究結果，建立了生化網絡，為黃瓜果實在農藥和葉面肥混合使用下的代謝途徑提供了機制分析。
結果和討論
黃瓜果實有機酸的針對性分析
有機酸是水果和蔬菜中的天然化合物。作為水果風味和營養物質的重要組成部分，水果中有機酸的含量和種類是決定水果品質的重要指標之一。在試驗過程中，分析了不同處理對黃瓜果實有機酸的影響。由圖1 (a-e)可以看出，不同處理，特別是T3處理(吡蚜酮、戊唑醇和葉面肥)黃瓜果實中有機酸含量均高于CK處理，在7d時差異達到了統計學意義。
酒石酸是黃瓜果實中所含的一種獨特成分，具有抑制人體糖向脂肪轉化的作用，被認為是一種天然的減肥食品�？箟难�酸(AsA)(維生素C)是一種眾所周知的抗氧化劑，具有解毒、抗癌和清除自由基的作用。葉面肥配合農藥的施用可顯著提高黃瓜果實中酒石酸和AsA的含量,表明混合使用肥料和殺蟲劑不能僅僅提高營養價值,也更好地抑制糖轉換成脂肪在人體內。
黃瓜果實抗氧化能力的針對分析
GST、POD、AsA、GSH在植物的解毒過程中發揮重要作用。圖1 (e-h)顯示，在0.17 d時，不同處理對植物的抗氧化能力有較大影響在0.17 d時，結果表明黃瓜果實能快速激活抗氧化系統以緩解外界脅迫。黃瓜果實抗氧化能力受農藥(T1和T2)的影響而增強，在葉面肥中添加農藥(T3)進一步增強，這與農藥快速消散一致。
在農藥(毒死蜱、樂果、狄氏劑)與肥料的混合使用中，抗氧化酶得到了增強，因為肥料中的微量元素提高了抗氧化酶的濃度，減少了農藥造成的抗氧化損傷。因此葉面肥和農藥的混合施用可顯著提高黃瓜果實的抗氧化活性，有利于促進農藥的消散。

圖1.不同處理對黃瓜果實有機酸含量及抗氧化能力的影響 T1:單獨使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮與戊唑醇合用；T3:吡蚜酮與戊唑醇、葉面肥配合使用。用不同字母(a, b, c)標記的條表示差異顯著(p < 0.05)。
 
不同處理對黃瓜果實整體代謝譜的影響
利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap HRMS代謝組學方法獲得黃瓜果實的代謝產物譜。
從圖2的火山圖可以看出，與其他處理相比，T3處理的樣品大部分都是上調的。與T2相比，T3處理下上調化合物在總差異化合物中所占比例接近100%，說明葉面肥的添加對農藥脅迫下黃瓜果實的代謝具有顯著影響。與T1相比，T2處理下下調的化合物在總差異化合物中所占比例接近100%，說明聯合施用農藥和單獨施用農藥顯著改變了黃瓜果實代謝。

圖2.不同組別的差異代謝物火山圖


圖3-1.黃瓜果實代謝譜數據的PCA評分圖 T1:單獨使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮與戊唑醇合用；T3:吡蚜酮與戊唑醇、葉面肥配合使用；QC:質量控制。


圖3-2.不同處理的OPLS-DA評分圖 T1:單獨使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮與戊唑醇合用；T3:吡蚜酮與戊唑醇、葉面肥配合使用。
 
注：圖3-1和圖3-2Pca和oplsda結果表明組間區分效果非常好。
 
綜合實驗結果揭示不同處理下黃瓜果實的代謝反應
1.不同處理對黃瓜果實代謝途徑的響應
生理變化是代謝變化的結果，代謝物豐度的變化反映了特定代謝途徑的抑制或激活，這也代表了代謝重排。將所有實驗結果整合到MetaboAnalyst分析生物通路。結果表明，鑒定的化合物涉及36個代謝途徑。本研究共構建了12條代謝途徑，包括氨酰- trna生物合成途徑；酪氨酸代謝；三羧酸循環；精氨酸和脯氨酸代謝；異喹啉生物堿生物合成；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝；苯丙氨酸代謝；半胱氨酸和蛋氨酸代謝；丙酮酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝；淀粉和蔗糖代謝；色氨酸代謝。

圖4.中樞代謝生物合成途徑的代謝產物網絡變化
 
圖4較為完整地展示了中樞代謝生物合成途徑的代謝產物網絡變化，包括糖酵解、TCA循環、氨基酸代謝和抗氧化系統代謝。雖然糖酵解相關的中間體沒有變化，但不同處理下的凈光合速率的增加表明糖酵解途徑被激活。此外，三羧酸循環中間體(檸檬酸和l -蘋果酸)的豐度上調，表明三羧酸循環發生了上調。糖酵解和三羧酸循環是能量相關的途徑。這兩個途徑的上調表明，混合農藥處理后，黃瓜果實產生更多的能量，尤其是葉面肥處理。同時，脂肪酸含量顯著降低，說明糖酵解和三羧酸循環產生的能量沒有積累，而是被消耗以維持正常的生理過程和/或增加防御相關活動。
 
2.不同處理對黃瓜果實氨基酸代謝的影響
不同處理下氨基酸含量的變化表明了黃瓜果實氮素代謝的重塑(圖5)。在本研究中，與兩種農藥（T2）的混合使用相比，添加氨基酸葉面肥（T3）實際上降低了5天時的氨基酸含量，表明葉面肥和農藥的混合使用可能會改變黃瓜果實中低分子量氮源的組成。然而，由于這個實驗只涉及黃瓜果實中的氨基酸的變化在5天，和氨基酸在黃瓜果實不斷合成和代謝，有必要對氨基酸進行動態監測，進一步研究了黃瓜果實中氨基酸轉換的潛在機制。

圖5.不同處理黃瓜果實中氨基酸的相對豐度
除絲氨酸外，其余脂肪氨基酸(纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)均有相同的響應趨勢：T1處理黃瓜果實中上述氨基酸含量普遍高于對照，T2處理和T3處理均降低了上述氨基酸含量。結果表明，吡蚜酮單獨施用和吡蚜酮與戊唑醇混合施用對黃瓜果實中部分脂肪族氨基酸含量的影響完全不同。
 
不同處理黃瓜果實中絲氨酸、色氨酸、組氨酸和脯氨酸含量均低于對照。生理結果表明，不同處理對植物生長有積極作用，即增加有機酸含量，促進光合作用。然而，不同處理對生長素生物合成的重要前體色氨酸含量沒有顯著影響。以往的研究報道，脯氨酸在許多植物中都是在環境脅迫下積累的，而脯氨酸的上調可以消除活性氧(ROS)，抑制脂質過氧化，有助于植物適應各種環境脅迫。這與本試驗中脯氨酸含量的降低不一致。一些研究人員發現，在鹽脅迫下，菌根植物的脯氨酸濃度低于非菌根植物，這可能是由于菌根植物的耐鹽性更高，以及其他耐鹽機制的增強。
 
本試驗中，黃瓜果實脯氨酸含量在5d時的降低可能與其他相關抗氧化能力的提高有關。此外，還與農藥脅迫的減少有關，即農藥造成的危害減少。芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)參與莽草-苯丙氨酸途徑。與對照相比，T1和T2處理中芳香氨基酸含量增加，T3處理降低。莽草酸-苯基丙酸途徑可產生多種抗氧化劑(如類黃酮和酚類)及其前體(如芳香族氨基酸)，以清除或抑制農藥脅迫下植物細胞中ROS（活性氧）的合成。
 
結 論
采用非靶向代謝組學和生理分析方法，研究了吡蚜酮、戊唑醇和葉面肥對黃瓜植株生長和果實代謝的影響。結果表明與單獨施用農藥或兩種農藥混合施用相比，葉面肥與農藥混合施用可提高葉綠素和氮含量，促進植物光合作用，從而調節黃瓜果實中相關代謝產物和代謝途徑，提高了黃瓜果實的品質和抗氧化能力，促進了農藥的消散。因此，葉面肥與農藥的混合施用是提高黃瓜果實品質、促進農藥在果實中消散的有效策略。
文/阿趣代謝組學