作為一種影響全球數百萬人生活的慢性疾病，骨關節炎（OA）主要誘發殘疾，關節僵硬和疼痛。OA 的藥物治療主要使用非甾體抗炎藥來緩解 OA 引起的疼痛和炎癥。然而，許多 OA 患者在疾病的后期階段需要關節置換療法。

骨髓來源的 MSCs（BMSCs）是一種來自骨髓的間充質干細胞，具有多能分化潛能，還可以進行自我更新，產生免疫調節反應，已被廣泛用于軟骨損傷和關節疾病的治療。此外，BMSCs 已在實驗和臨床試驗中用于治療 OA。雖然 BMSCs 在治療 OA 中的詳細機制尚不清楚，但懷疑 BMSCs 通過分泌一系列免疫因子和細胞因子來發揮免疫調節和抗炎作用。

缺氧可導致新陳代謝水平升高。在缺氧環境中培養 MSCs 期間，細胞顯示出一組獨特的分化，增殖和衰老特性。除此之外，MSCs 和 BMSCs 在低濃度氧氣條件下的分化行為可以幫助我們了解這些細胞在嚴重缺氧下的修復潛力。然而，當 MSCs 和 BMSCs 被植入嚴重缺氧的環境中時，它們有時無法正確區分。

UTX 基因中的純合性缺失突變，也稱為賴氨酸特異性去甲基化酶6A（KDM6A），已在許多原發性腫瘤中發現。SOX9 是一種軟骨轉錄因子，其信號激活水平降低是由 OA 發病機制期間關節軟骨的嚴重損傷引起的。

據報道，缺氧暴露可激活 KDM6A 的表達，KDM6A 隨后使 SOX9 啟動子去甲基化。SOX9 的下調參與 OA 的發病機制。因此，同濟大學附屬上海市第四人民醫院骨科、同濟大學附屬上海市肺科醫院、上海交通大學附屬第一人民醫院骨科的研究課題組曾建立了 OA 動物模型，并在正常氧或缺氧下與 BMSCs 共培養的關節軟骨細胞（ACCs）進行治療，以研究 BSMC 預處理對 OA 的治療效果。
 

與 BMSCs 共培養可提高 ACCs 的軟骨分化

在常氧或缺氧條件下，在單一培養和與 BMSCs 共培養下測量 ACC 顆粒的大小和重量。如圖1所示，通過與 BMSCs 共培養，ACC 顆粒的尺寸（圖1 a）和重量（圖1 b）增加。此外，作為軟骨分化的主要參與者，發現在缺氧條件下與 BMSCs 共培養的 ACCs 中 S-GAG（硫酸化糖胺多糖）水平顯著升高（圖1 c）。此外，通過與 BMSCs 共培養，ACCs 的增殖速率顯著提高（圖1 d）。
 

圖1 sGAG 檢測表明，與 BMSCs 共培養可增強 ACCs 的軟骨分化。

與 BMSCs 共培養的 ACCs 中 KDM6A 和 SOX9 的表達增加

定量 RT-PCR 和蛋白質印跡分析 KDM6A 和 SOX9 的表達。缺氧條件下，KDM6A mRNA 在與 BMSCs 共培養的 ACCs 中顯著上調（圖2 a）。同樣，在缺氧下與 BMSCs 共培養，ACCs 中的 SOX9 mRNA 表達也升高（圖2 b）。蛋白質印跡分析顯示 KDM6A 和 SOX9 的蛋白質表達趨勢相似（圖2 c）。
 

圖2 定量實時熒光定量 PCR 和蛋白質印跡表明，在正常氧和缺氧條件下，KDM6A 和 SOX9 在與 BMSCs 共培養的 ACCs 中表達增加。

2型膠原蛋白和 Aggrecan mRNAs 在與 BMSCs 共培養的 ACCs 中的表達升高

此外，在常氧和缺氧下，在單一培養 ACCs 和與 BMSCs 共培養的 ACCs 中評估了 2型膠原蛋白和 Aggrecan（軟骨蛋白聚糖）的 mRNA 表達。缺氧條件下，2型膠原蛋白（圖3 a）和 Aggrecan（圖3 b）的 mRNA 表達在與 BMSCs 共培養的 ACCs 中上調。
 

圖3 實時熒光定量 PCR 表明，在正常氧和缺氧條件下，與 BMSCs 共培養的 ACCs 中，2型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 表達增強。

在與 BMSCs 共培養的 ACCs 中，SOX9 啟動子的 DNA 甲基化降低

基因啟動子中的 DNA 甲基化可以對基因表達進行負調節。如圖4 所示，進行了亞硫酸氫鹽測序 PCR，以分析在各種條件下處理的 ACCs 中 SOX9 啟動子的 DNA 甲基化狀態。缺氧條件下，與 BMSCs 共培養的 ACCs 中，SOX9 啟動子的 DNA 甲基化顯著降低。
 

圖4 亞硫酸氫鹽測序PCR 表明，在正常氧和缺氧狀態下，與 BMSCs 共培養的 ACCs 中 SOX9 啟動子的 DNA 甲基化降低。

與 BMSCs 共培養抑制了 ACCs 的凋亡

使用流式細胞術評估 ACCs 在不同條件下的凋亡狀態。如圖5 所示，在缺氧狀態下與 BMSCs 共培養顯著抑制了 ACCs 的凋亡。這些結果表明，ACCs 和 BMSCs 的共培養顯著抑制了 ACCs 的凋亡。
 

圖5 流式細胞術表明，在正常氧和缺氧狀態下，與 BMSCs 共培養可降低 ACCs 的凋亡。

ACCs 與 BMSCs 共培養可減輕軟骨損傷

建立 OA 大鼠模型，并在正常和缺氧條件下 BMSCs 與 ACCs 共培養。對 OA 大鼠模型軟骨病變進行 Mankin 病理評分（骨性關節炎軟骨退變程度進行評價的通用標準），發現 OA 大鼠中顯示出顯著更高的 Mankin 評分。在缺氧下用 ACCs 與 BMSCs 共培養后，OA 大鼠的 Mankin 評分顯著降低（圖6）。
 

圖6 軟骨病變的 Mankin 分級表明，在正常氧和缺氧下，BMSCs 與 ACCs 共培養可減弱 OA 大鼠軟骨病變。

BMSCs 與 ACCs 共培養增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的表達

使用 qPCR 檢查 KDM6A 和 SOX9 在 OA 大鼠中的 mRNA 表達。OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的 mRNA 表達明顯被抑制，而在正常氧和缺氧下，ACCs 與 BMSCs 共培養的 OA 大鼠 KDM6A（圖7 a）和 SOX9（圖7 b）的表達顯著增加。此外，在不同條件下評估了 SOX9 啟動子的 DNA 甲基化。OA 大鼠 SOX9 啟動子的 DNA 甲基化逐漸增加，而在正常氧和缺氧下 ACCs 與 BMSC 共培養的 OA 大鼠中 SOX9 啟動子的 DNA 甲基化降低（圖7 c）。
 

圖7 定量實時熒光定量 PCR 和亞硫酸氫鹽測序 PCR 表明，與 BMSCs 共培養的 ACCs 處理增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 mRNA 的表達。

總之，該研究數據表明，缺氧通過促進 KDM6A 表達和激活 SOX9 信號通路來改善 BMSCs 的分化和增殖。這是 BMSCs 分化的一種新機制，為 OA 治療帶來了光明的前景。

參考文獻：Zhi Z, Zhang C, Kang J, Wang Y, Liu J, Wu F, Xu G. The therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on osteoarthritis is improved by the activation of the KDM6A/SOX9 signaling pathway caused by exposure to hypoxia. J Cell Physiol. 2020 Oct;235(10):7173-7182. doi: 10.1002/jcp.29615. Epub 2020 Feb 5. PMID: 32020624.
原文鏈接：http://group9-s.ccame.net/32020624/

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