非靶代謝組學在研究慢性腎臟病的發病機制與可能治療靶點中的應用
百趣代謝組學資訊:慢性腎病的延緩方法有了！
文章標題：Metabolomics analysis of human plasma reveals decreased production of trimethylamine N-oxide retards the progression of chronic kidney disease
發表期刊：British Journal of Pharmacology
發表時間：2022.1
影響因子：8.739
合作客戶：上海市第十人民醫院、重慶醫科大學
百趣生物提供服務：非靶代謝組學
研究背景
慢性腎臟病（CKD）是一個全球性的公共衛生問題，也是導致死亡的主要原因之一。然而，CKD的發病機制和干預方法尚不完全清楚。因此，一些創新的組學技術被用來研究CKD的發病機制和可能的治療靶點，包括蛋白質組學和代謝組學，以減緩CKD的進展。
結果和討論
01人血漿的代謝組學分析揭示了健康組和尿毒癥患者的潛在標志物（PM）
由30名尿毒癥患者和30名健康組組成，進行代謝組學分析。為了檢驗數據的質量，我們首先分析了肌酐質量強度（Cr）與臨床試驗中肌酐血漿濃度之間的相關性。如圖1a、b所示，在陽性模式（圖1a）和陰性模式（圖1b）中，肌酐強度的對數值與血漿肌酐的對數水平呈良好的線性相關（兩種模式中的R值均大于0.9）。
圖1. 基于LC-MS/MS的非靶向代謝組學數據的質量評估
所有組中大多數代謝物的偏差均小于標準偏差的三倍。然而，在所有組中，所有處于正模式和負模式的代謝物的偏差均低于標準偏差的六倍。因此，對樣本和質量控制進行無監督主成分分析。然后，對處理后的數據進行監督正交偏最小二乘判別分析。用二維得分圖建立一個預測成分和一個正交成分模型，使用方法中描述的標準，確定了18個潛在標記物（表3），其中尿毒癥患者血漿中只有一個潛在標記物減少。表中也顯示了這些潛在標記。
02、潛在標志物的相關分析確定TMAO是與CKD進展相關的標志物
對代謝組學潛在標記物進行定量驗證，N-乙酰丙氨酸、D-山梨醇和L-焦谷氨酸被排除在進一步的分析之外。為了確定CKD進展最有希望的標志物，我們對潛在標志物的血漿水平與血漿肌酐和eGFR進行了相關分析。與血漿肌酐呈正相關，與eGFR呈負相關，相關系數大于0.79（表4）。此外，血漿TMAO與血漿肌酐和eGFR的回歸分析表明，血漿TMAO與肌酐和eGFR密切相關，相關系數均大于0.8（圖3）。
圖2. 血漿TMAO水平與血漿肌酐TMAO水平相關性圖（n=195）
03、TMAO抑制細胞活性并上調纖維化相關蛋白
為了測試TMAO對腎臟的影響，我們首先測試了TMAO對HK-2細胞的影響。用TMAO處理細胞24小時后，細胞活力略有改變（圖4A）。然而，當TMAO濃度小于1.5μM時，將細胞與TMAO孵育48小時可顯著降低細胞活力，且呈劑量相關。當TMAO濃度大于1.5μM時，細胞活力似乎達到一個等級（圖4B）。此外，用TMAO處理細胞48小時后，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的蛋白表達明顯增加（圖4C,d），而TGF-β、III型膠原（COL3A1）和纖維連接蛋白的蛋白水平僅略有改變。
圖3. TMAO通過促進腎纖維化在體外和小鼠體內引起腎損傷
04、TMAO在體內引起腎損傷并上調纖維化相關蛋白
給小鼠喂食TMAO后，其體重略有變化，但在視覺上顯著降低了腎臟重量（圖4f,g）和腎臟與體重的比率（圖4h）。相比之下，兩組小鼠的心臟質量和心體質量比均無顯著變化。給小鼠喂食TMAO可顯著提高TMAO（圖4i）和肌酐（圖4j）的血漿水平。此外，給小鼠提供TMAO可增加α-Sma蛋白的腎臟表達（圖4K,l）。
圖4. TMAO通過促進腎纖維化在體外和小鼠體內引起腎損傷。
05、抑制TMAO生成減輕腺嘌呤誘導的體內腎損傷
治療前，四組小鼠的體重略有不同。與對照飲食相比，ARD飲食的消耗量顯著減少。用ARD喂養小鼠可顯著降低小鼠體重（圖5A）和腎臟重量（圖4B）。用抗生素雞尾酒（ABX）治療小鼠可減輕ARD誘導的小鼠體重減輕（圖5A）。DMB或ABX治療可減輕ARD引起的腎重量減少（圖5b）。ARD喂養顯著提高了血漿TMAO水平，而ABX或DMB處理顯著降低了血漿TMAO水平（圖5c）。正如預期的那樣，ARD喂養顯著提高了血漿肌酐水平，ABX或DMB治療顯著阻斷了這一效應（圖5d）。此外，ARD喂養增加了α-Sma的蛋白表達，而ABX或DMB處理會減弱α-Sma的表達（圖5e,f）。相比之下，ABX或DMB治療均未顯著逆轉ARD誘導的心臟質量下降。
圖5. TMAO是減緩小鼠模型腎功能不全的治療靶點
組織學分析表明，ARD給藥導致視覺腎纖維化（圖6b,fand S4B），而DMB（圖6c）或ABX治療（圖6d）緩解ARD誘導的腎纖維化。圖6e和圖6j總結了半定量結果。此外，在偏振光顯微鏡下觀察接受ARD的小鼠腎組織的天狼星紅染色導致弱折射和淺紅色，表明本研究中主要的膠原沉積可能是II型膠原。
圖6. 用3,3-二甲基1-丁醇（DMB）或抗生素混合物（ABX）治療可減輕富含腺嘌呤的飲食（ARD）誘導的腎纖維化
結論
在第一隊列中發現的18個潛在標記物中，氧化三甲胺（TMAO）被確定為一個有希望的標記物，并且它與第二隊列中CKD患者的腎功能最佳相關。TMAO處理HK-2細胞后，細胞活力降低，α-平滑肌肌動蛋白表達上調。在小鼠中，含有TMAO的飲食減少了腎臟重量，增加了α-平滑肌肌動蛋白的蛋白表達。此外，通過使用3,3-二甲基-1-丁醇抑制TMAO的生物合成途徑或使用抗生素混合物破壞腸道微生物群功能來控制TMAO的產生，可以減輕CKD小鼠模型的腎損傷。結論和意義：本次研究數據表明，減少TMAO的產生可能是一種新的策略，可以減輕CKD腎損傷的進展。
文/阿趣代謝組學
文章標題：Metabolomics analysis of human plasma reveals decreased production of trimethylamine N-oxide retards the progression of chronic kidney disease
發表期刊：British Journal of Pharmacology
發表時間：2022.1
影響因子：8.739
合作客戶：上海市第十人民醫院、重慶醫科大學
百趣生物提供服務：非靶代謝組學
研究背景
慢性腎臟病（CKD）是一個全球性的公共衛生問題，也是導致死亡的主要原因之一。然而，CKD的發病機制和干預方法尚不完全清楚。因此，一些創新的組學技術被用來研究CKD的發病機制和可能的治療靶點，包括蛋白質組學和代謝組學，以減緩CKD的進展。
結果和討論
01人血漿的代謝組學分析揭示了健康組和尿毒癥患者的潛在標志物（PM）
由30名尿毒癥患者和30名健康組組成，進行代謝組學分析。為了檢驗數據的質量，我們首先分析了肌酐質量強度（Cr）與臨床試驗中肌酐血漿濃度之間的相關性。如圖1a、b所示，在陽性模式（圖1a）和陰性模式（圖1b）中，肌酐強度的對數值與血漿肌酐的對數水平呈良好的線性相關（兩種模式中的R值均大于0.9）。
圖1. 基于LC-MS/MS的非靶向代謝組學數據的質量評估表3. 健康對照組和CKD患者不同階段潛在代謝組學標志物的血漿濃度
對代謝組學潛在標記物進行定量驗證，N-乙酰丙氨酸、D-山梨醇和L-焦谷氨酸被排除在進一步的分析之外。為了確定CKD進展最有希望的標志物，我們對潛在標志物的血漿水平與血漿肌酐和eGFR進行了相關分析。與血漿肌酐呈正相關，與eGFR呈負相關，相關系數大于0.79（表4）。此外，血漿TMAO與血漿肌酐和eGFR的回歸分析表明，血漿TMAO與肌酐和eGFR密切相關，相關系數均大于0.8（圖3）。
表4. 血漿電位標志物與血漿Cr和eGFR的相關性
圖2. 血漿TMAO水平與血漿肌酐TMAO水平相關性圖（n=195）為了測試TMAO對腎臟的影響，我們首先測試了TMAO對HK-2細胞的影響。用TMAO處理細胞24小時后，細胞活力略有改變（圖4A）。然而，當TMAO濃度小于1.5μM時，將細胞與TMAO孵育48小時可顯著降低細胞活力，且呈劑量相關。當TMAO濃度大于1.5μM時，細胞活力似乎達到一個等級（圖4B）。此外，用TMAO處理細胞48小時后，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的蛋白表達明顯增加（圖4C,d），而TGF-β、III型膠原（COL3A1）和纖維連接蛋白的蛋白水平僅略有改變。
圖3. TMAO通過促進腎纖維化在體外和小鼠體內引起腎損傷給小鼠喂食TMAO后，其體重略有變化，但在視覺上顯著降低了腎臟重量（圖4f,g）和腎臟與體重的比率（圖4h）。相比之下，兩組小鼠的心臟質量和心體質量比均無顯著變化。給小鼠喂食TMAO可顯著提高TMAO（圖4i）和肌酐（圖4j）的血漿水平。此外，給小鼠提供TMAO可增加α-Sma蛋白的腎臟表達（圖4K,l）。
圖4. TMAO通過促進腎纖維化在體外和小鼠體內引起腎損傷。治療前，四組小鼠的體重略有不同。與對照飲食相比，ARD飲食的消耗量顯著減少。用ARD喂養小鼠可顯著降低小鼠體重（圖5A）和腎臟重量（圖4B）。用抗生素雞尾酒（ABX）治療小鼠可減輕ARD誘導的小鼠體重減輕（圖5A）。DMB或ABX治療可減輕ARD引起的腎重量減少（圖5b）。ARD喂養顯著提高了血漿TMAO水平，而ABX或DMB處理顯著降低了血漿TMAO水平（圖5c）。正如預期的那樣，ARD喂養顯著提高了血漿肌酐水平，ABX或DMB治療顯著阻斷了這一效應（圖5d）。此外，ARD喂養增加了α-Sma的蛋白表達，而ABX或DMB處理會減弱α-Sma的表達（圖5e,f）。相比之下，ABX或DMB治療均未顯著逆轉ARD誘導的心臟質量下降。
圖5. TMAO是減緩小鼠模型腎功能不全的治療靶點
圖6. 用3,3-二甲基1-丁醇（DMB）或抗生素混合物（ABX）治療可減輕富含腺嘌呤的飲食（ARD）誘導的腎纖維化在第一隊列中發現的18個潛在標記物中，氧化三甲胺（TMAO）被確定為一個有希望的標記物，并且它與第二隊列中CKD患者的腎功能最佳相關。TMAO處理HK-2細胞后，細胞活力降低，α-平滑肌肌動蛋白表達上調。在小鼠中，含有TMAO的飲食減少了腎臟重量，增加了α-平滑肌肌動蛋白的蛋白表達。此外，通過使用3,3-二甲基-1-丁醇抑制TMAO的生物合成途徑或使用抗生素混合物破壞腸道微生物群功能來控制TMAO的產生，可以減輕CKD小鼠模型的腎損傷。結論和意義：本次研究數據表明，減少TMAO的產生可能是一種新的策略，可以減輕CKD腎損傷的進展。
文/阿趣代謝組學
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