細胞外囊泡EVs熒光標記的機遇與挑戰(zhàn)
細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在機體的多種生理病理過程中均發(fā)揮著重要作用，良好的結構穩(wěn)定性、生物相容性及天然的轉運能力使其成為理想的藥物遞送載體和治療制劑。不管是在工業(yè)生產還是科學研究中，EVs的質量控制都至關重要，國際細胞外囊泡協(xié)會(international society for extracellular vesicles, ISEV)一直在努力推動和完善相關標準，如MISEV2014、MISEV2018以及即將發(fā)布的MISEV2022，同時工業(yè)界也試圖確立適用于工業(yè)產品的質控標準。除了粒徑、濃度等常規(guī)物理參數(shù)的檢測，更重要的是對EVs的純度、蛋白標志物、核酸以及載物等功能性分子進行表征，而內容物的定性定量分析通常需要通過熒光標記來實現(xiàn)。
近日Lonza集團的研發(fā)團隊發(fā)表了題為“Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms”的文章，作者分別利用高分辨單顆粒表征平臺nFCM(NanoFCM)和F-NTA對EVs進行表征，探討EVs熒光表征過程中面臨的問題與挑戰(zhàn)。文章對EVs純度測定過程中染料的選擇、蛋白標志物分析、RNA檢測、復雜體系中EVs的表征等方面進行全面研究，指出在EVs綜合表征中面臨的問題與注意事項，供廣大EVs研究者參考。
EVs純度鑒定
首先，分別選取兩種細胞膜染料和兩種細胞質染料對EVs的純度進行鑒定。nFCM結果顯示，無論是細胞膜染料(CMG/CMR)還是細胞質染料(CFSE/CTR)，EVs陽性顆粒的比例均高達90%左右，且EVs尺寸越大，結合的染料越多，熒光強度也越高。由于具備超高的散射和熒光靈敏度，nFCM證實了幾種染料標記效率的一致性(圖1)。同樣的樣品和染色方法用F-NTA檢測，經CFSE標記的EVs陽性率為88%，與nFCM結果相當，而對于CMG染料標記，F(xiàn)-NTA測得的陽性顆粒比例只有32%左右，粒徑分布顯示F-NTA檢測到的是大的EVs。這個案例提醒研究者對于EVs純度分析不僅需要關注不同染料間的標記和檢測效率問題，還需要關注表征平臺的檢測能力。
圖1.不同染料標記EVs純度的效率
在早期的推文中小編介紹過不同公司的抗體特異性存在差異重磅！安德森癌癥中心用NanoFCM直篩外泌體特異性抗體！，抗體標簽也是影響EVs標記效率的一個因素。該研究對比了PE、AF488、AF647、APC四種標簽的CD9抗體，發(fā)現(xiàn)PE和AF488的標記比例優(yōu)于AF647和APC，比例在50%左右；進一步選用PE和AF488兩種標簽的CD9、CD63和CD81抗體，發(fā)現(xiàn)在HT29和HEK293細胞系中不同標簽抗體標記的效果沒有顯著差別(圖2)，說明在EVs蛋白標記過程中研究者需要格外關注抗體特異性、標簽的選擇對標記效率的影響。
圖2.不同熒光標簽對抗體標記效率的影響
除了抗體標簽，未結合的抗體對EVs的陽性率也存在影響。文章對比了稀釋法(Dilution)、超濾(UF)、尺寸排阻(SEC)三種方法對游離抗體去除效果和標記比例的影響。由于不涉及純化過程，理論上稀釋法對EVs的影響是最少的。nFCM結果顯示三種方法得到的CD9、CD63、CD81陽性率基本一致，說明稀釋法可以用來準確地測定EVs蛋白的比例，同時結果也證明UF和SEC純化過程對EVs蛋白的陽性率沒有影響(圖3)。說明nFCM可通過稀釋法測定EVs蛋白表達比例，省略超速離心去除游離抗體的操作，極大縮短操作時間，同時真實反映EVs蛋白表達比例和強度。
圖3.nFCM測定游離抗體去除方法對標記比例的影響
前面介紹的案例都是基于EVs純品的分析，雜質顆粒含量非常低，對測定結果的影響相對較小。進一步對較復雜的細胞上清(CCM)進行直接檢測，作者指出對于EVs純品和CCM樣品，nFCM的結果令人驚訝的一致，CFSE與CMG陽性率例均在90%左右，與超離純化的 HT29 EVs樣品結果一致，說明nFCM平臺既適用于純的EVs樣品，也可用于細胞上清樣品中EVs的直接檢測，具有廣泛的應用場景；而在F-NTA平臺，CFSE與CMC對于HT29細胞上清EVs標記陽性率分別為33%和27%，作者解釋稱可能是由于CCM樣品復雜的成分導致F-NTA的檢測存在差異；對于蛋白比例檢測，3種EVs蛋白marker總比例高達188.5%，遠遠超過100%，文章指出可能是F-NTA熒光的靈敏度高于散射，大量小顆粒的散射信號未檢出，導致比例高于100%。
圖4.CCM樣品EVs純度和蛋白比例測定
與F-NTA相比，nFCM還可以利用多色熒光標記策略對sEV亞群進行表征。為研究EVs的抗體單標和雙標之間是否相互影響，作者選取CD9-AF488和CD81-PE分別進行單獨標記和雙標，對比標記比例的變化。結果表明這兩個蛋白之間，不管是單獨標記或雙標，陽性率差異不顯著；另外，用EVs染料CTR和CD81同時標記EVs，發(fā)現(xiàn)所有CD81陽性的EVs的CTR均呈現(xiàn)陽性，說明CD81陽性的顆粒，均是EVs！(圖5)。nFCM可以準確識別抗體標記的所有EVs，并且確認抗體陽性率的準確性。
圖5.EVs抗體單標和雙標的影響
綜上，Lonza集團的研發(fā)團隊對EVs熒光標記過程中的各項指標進行綜合對比，對EVs純度測定過程中染料的選擇、蛋白標志物分析、復雜體系中EVs的表征等進行研究，對工業(yè)生產中EVs的質量控制提供了新思路和新方法。
作者肯定了nFCM用于EVs檢測的準確性和靈敏度，提出EVs純度表征方法，初次采用CD9/63/81幾種抗體的混合物驗證EVs的純度，并對細胞上清中的EVs進行直接檢測，得到了跟EVs純品相一致的結果。另外作者指出nFCM對于EVs熒光檢測具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性(圖6)，nFCM可在單顆粒水平對EVs的散射和熒光進行同時檢測，單次采樣即可實現(xiàn)蛋白與EVs(或蛋白間)的“共定位”分析，是EVs質量控制中不可或缺的工具。
圖6.文中關于nFCM的評價
Lonza Walkersville(龍沙集團)是全球CDMO龍頭企業(yè)，一家以生命科學為主導，在生物化學、精細化工、功能化學等行業(yè)均處于領先地位的全球性跨國公司，具有一百多年歷史，總部位于瑞士巴塞爾。
圖7.Lonza集團EVs工作流程圖(圖片來源：Lonza官方網站)
Lonza目前已采購3臺NanoFCM，分別用于EVs研發(fā)、生產質控和CRO項目，致力于EVs大規(guī)模生產、純化和表征，后續(xù)將應用于EVs載藥領域。2021年11月，Lonza收購了Codiak公司位于馬薩諸塞州Lexington的外泌體生產基地，正式成為Codiak管線的戰(zhàn)略制造合作伙伴。屆時Lonza將借助Codiak的高通量外泌體生產技術向第三方提供服務，并開發(fā)先進的外泌體產品，助力細胞與基因治療產業(yè)。
參考文獻：
- Fortunato D, Mladenović D, Criscuoli M, et al. Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(19): 10510.
- https://www.lonza.com/
- https://www.lonza.com/news/2021-11-02-13-01
- 納米流式檢測技術 (nFCM) 評估六種膜燃料標記細胞外囊泡的性能研究
- 模擬HIV膜融合機制開發(fā)的創(chuàng)新病毒樣顆粒T-FVLPmCAR載體技術及應用
- 納米流式技術在單顆粒水平定量分析sEVs表面的唾液酸中的應用
- ApogeeFlow納米流式協(xié)助Mayo Clinic揭示早期結直腸癌新生物標志物
- Apogee Flow助力COVID-19重癥感染導致凝血和止血障礙研究
- NanoFCM納米流式檢測技術在探究空載對LNPs結構表征影響中的應用
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- JEV文獻解讀：一種新型外泌體支架蛋白的發(fā)現(xiàn)及其優(yōu)勢與應用
